酵母單、雙雜交PPT

酵母單、雙雜交技術(shù)目錄CONTENTS酵母單雜交技術(shù)2膜系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)3賽爾生物酵母單、雙雜交技術(shù)服務(wù)5酵母單、雙雜交在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用4核系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)11酵母雙雜交--基于GAL4的雙雜交核系統(tǒng)Part

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，用來研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到。既可用來研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也適用于高等植物蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。核系統(tǒng)酵母雙雜交功能鑒定兩個(gè)蛋白之間的相互作用發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白互作的蛋白確定蛋白相互作用的區(qū)域核系統(tǒng)酵母雙雜交初識(shí)MATa型，篩選標(biāo)記為：trp1，leu2報(bào)告基因?yàn)椋篈bAr，HIS3，ADE2，

MEL1由一些營養(yǎng)選擇標(biāo)記HIS3和(或)編碼酶的基因IacZ基因組成，能顯示“誘餌’和“獵物”相互作用的基因pGBKT7：篩選標(biāo)志為Trp1，用于表達(dá)DNA-BD與Bait)的融合蛋白pGADT7：篩選標(biāo)志為Leu，用于表達(dá)DNA-AD與Prey的融合蛋白MATα型，篩選標(biāo)記為：trp1，leu2報(bào)告基因?yàn)椋簂acZ（對(duì)?-gal顯陽性）

MEL1（對(duì)α-gal顯陽性）Y187菌株Y2HGold菌株報(bào)告基因配套質(zhì)粒核系統(tǒng)酵母雙雜交報(bào)告株

報(bào)告株指經(jīng)改造的、含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

最常用的是酵母細(xì)胞,其作為報(bào)告株的酵母雙雜交統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)：易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)告基因酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合改造后的酵母細(xì)胞的特點(diǎn):基因組中GAL4是缺失型的基因組中引入額外的報(bào)告基因Leu、Trp、His核系統(tǒng)酵母雙雜交常用結(jié)構(gòu)域DNA-BDYTH常用：

GAL4系統(tǒng)DNA-AD真核細(xì)胞：GAL4系統(tǒng)(具有核定位序列)原核細(xì)胞：LexA系統(tǒng)(不具有核定位序列)GAL4、VP16、B42核系統(tǒng)酵母雙雜交原理PromoterlacZ(orHIS)reportergeneGALUASTranscriptionDNA-BDDNA-ADBaitPreyDNA-BDDNA-ADDNA-BDBaitDNA-ADPrey文庫構(gòu)建流程＋＋dscDNAY187SD/-Leu篩選cDNA文庫的評(píng)價(jià)及鑒定文庫分裝及凍存cDNA文庫擴(kuò)增目的基因合成目的片段與載體的連接大腸桿菌感受態(tài)的制備誘餌質(zhì)粒構(gòu)建流程誘餌質(zhì)粒毒性及自激活驗(yàn)證菌液PCR鑒定核定位檢測互作蛋白篩選流程1ml

文庫菌4ml誘餌菌混合培養(yǎng)雜交融合-二倍體篩選回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

在細(xì)胞裂解物中，加入結(jié)合在固相支持物上的某種特異性抗體共孵育，該抗體就能夠與其抗原形成免疫復(fù)合物。被抗體沉淀下來的靶抗原又在裂解液中共沉淀了一種結(jié)合伴侶蛋白。那些不能被沉淀下來的蛋白就會(huì)被洗滌走。然后進(jìn)行SDS和Westernblot分析。在co-IP中，當(dāng)相關(guān)蛋白能夠被共沉淀下來時(shí)通常假定這些蛋白在細(xì)胞水平上與靶蛋白的功能相關(guān)。免疫共沉淀的原理細(xì)胞裂解液與結(jié)合在固相支持物上的抗體共孵育互作蛋白CO-IP驗(yàn)證目的基因引物模板--回轉(zhuǎn)驗(yàn)證陽性克隆質(zhì)粒擴(kuò)增目的基因pGBKT7-Myc-BaitpCDNA3.1-HA-Prey共轉(zhuǎn)染CO-IP驗(yàn)證上拉下拉2酵母單雜交技術(shù)Part

酵母單雜交技術(shù)最早是從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，酵母雙雜交技術(shù)通過對(duì)報(bào)告基因的表型進(jìn)行檢測以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)間相互作用研究，而酵母單雜交技術(shù)則通過對(duì)報(bào)告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控。酵母單雜交基本原理在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代DNAGla4結(jié)合位點(diǎn)。該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gla4的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報(bào)告基因的表達(dá)。酵母單雜交基本原理誘餌（Bait）--DNA目的片段，或者一段誘餌序列，通過單拷貝或者隨即拷貝克隆到pAbAi載體上，構(gòu)建好的pBait-AbAi載體通過同源重組可高效整合到Y(jié)1HGold酵母菌株中，并產(chǎn)生誘餌特異性報(bào)告菌株。

獵物(Prey)—獵物蛋白，被融合到含有酵母GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（GAL4AD）表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)，通過共轉(zhuǎn)化SMARTPCR擴(kuò)增的cDNA和線性化pGADT7-Rec載體到酵母Y1HGold誘餌報(bào)告菌株中可以直接構(gòu)建好酵母中的獵物文庫。酵母單雜交原理將一至三個(gè)目的DNA重復(fù)序列克隆至pAbAi報(bào)告載體，然后整合到Y(jié)1HGold酵母基因組中以構(gòu)建一個(gè)誘餌特異的菌株，一旦文庫中的獵物蛋白質(zhì)與誘餌序列相結(jié)合，就會(huì)激活A(yù)bA抗性（AbAr）基因的表達(dá)，從而能夠在含有抗生素AbA的培養(yǎng)基上生長。目的基因合成目的片段與載體的連接pBait-AbAi構(gòu)建流程PCR鑒定誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌Y1HGold檢測誘餌菌株AbA’基因的表達(dá)目的確定進(jìn)行文庫篩選時(shí)抑制誘餌菌株報(bào)告基因本底表達(dá)所需的AbA最低濃度文庫構(gòu)建及篩選流程＋＋dscDNAY1HGold[Bait/AbAi]cDNA融合表達(dá)文庫的篩選陽性克隆的鑒定及cDNA質(zhì)粒的分離鑒別陽性及假陽性互作，陽性克隆測序分析3酵母雙雜交--Sos蛋白介導(dǎo)的雙雜交膜系統(tǒng)Part

Sos蛋白介導(dǎo)的雙雜交膜系統(tǒng)是把蛋白質(zhì)相互作用的場所從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到酵母的細(xì)胞膜上，通過應(yīng)用2個(gè)蛋白質(zhì)相互作用后對(duì)Ras信號(hào)通路的恢復(fù)作用而取代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制，克服了傳統(tǒng)雙雜交系統(tǒng)的一些局限性。膜系統(tǒng)酵母雙雜交初識(shí)pSos：篩選標(biāo)志為Leu，用于構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pMyr：篩選標(biāo)志為Ura，編碼十四烷基化膜定位

信號(hào)(Myr)，加入galactose可誘導(dǎo)表達(dá)MATα型，

其基因的1328位氨基酸殘基發(fā)生點(diǎn)突變，編碼脒基核苷酸交換因子，該因子結(jié)合并激活Ras，啟動(dòng)RaS信號(hào)傳導(dǎo)途徑生長溫度：25℃可以生長，37℃不可以生長CdC25H菌株配套質(zhì)粒Sos蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)原理人類Sos蛋白和所研究的基因融合而成誘餌蛋白。靶蛋白上連有一個(gè)十四烷基化（Myristylation）膜定位信號(hào)，它使靶蛋白錨定到細(xì)胞膜上。誘餌和靶蛋白的相互作用使人類Sos蛋白在酵母細(xì)胞膜上定位，從而激活Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)（cascade）。將誘餌蛋白克隆到pSos載體中，可表達(dá)產(chǎn)生hSos和誘餌蛋白的融合蛋白靶蛋白基因與pMyr載體相連接表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白可以將其固定在細(xì)胞膜上將文庫和誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)中誘餌蛋白與靶蛋白融合表達(dá)如果靶蛋白和誘餌蛋白相互作用，則hSos蛋白即可固定于細(xì)胞膜上，hSos蛋白激活Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑酵母能夠在37℃

生長酵母雙雜交系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)過程確定酵母菌表型營養(yǎng)缺陷型篩選酵母菌株標(biāo)志性表型的鑒定接種于YPDA培養(yǎng)基，25℃有菌生長，37℃無菌生長Trp(-)、Leu(-)、His(-)、Ura(-)不能生長，在YPDA上可以生長檢測回復(fù)突變文庫構(gòu)建流程＋dscDNA連接并轉(zhuǎn)化XL1-blue感受態(tài)細(xì)菌cDNA文庫的評(píng)價(jià)及鑒定文庫分裝及凍存cDNA文庫的擴(kuò)增Amp抗性陽性克隆挑選目的基因合成目的片段與載體的連接誘餌質(zhì)粒構(gòu)建流程誘餌質(zhì)粒自激活及細(xì)胞質(zhì)定位檢測重組鑒定重組質(zhì)粒純化自激活檢測（排除bait蛋白可與myristlyationsignal結(jié)合）細(xì)胞質(zhì)定位檢測（用于驗(yàn)證Sos-bait融合蛋白可以正確定位于胞漿中）誘餌蛋白表達(dá)WB驗(yàn)證互作蛋白篩選流程0.1ml

文庫菌1ml誘餌質(zhì)粒菌雜交融合篩選回轉(zhuǎn)驗(yàn)證陽性克隆挑選和驗(yàn)證酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞SD/glu(–UL)SD/gala(–UL)SD/glu(–UL)SD/gala(–UL)25℃37℃陽性對(duì)照++-+陰性對(duì)照++--克隆++-+再次驗(yàn)證37℃培養(yǎng)SD/glu(–UL)和SD/gala(–UL)重復(fù)驗(yàn)證陽性克隆質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)免疫共沉淀驗(yàn)證其相互作用

從抽提出的pMyr質(zhì)粒上，將插入片段亞克隆到真核表達(dá)載體pCD3cmyc上，用小提純化試劑盒純化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。用鼠抗cmyc抗體作為一抗進(jìn)行westernblot。4酵母單、雙雜交在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用Part酵母單雜交在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用1、確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。2、分離編碼結(jié)合于目的順式作用元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)的新基因。3、定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。酵母雙雜交在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

通過細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)間的相互作用或蛋白質(zhì)與其它分子間的相互作用完成的病毒學(xué)研究

可以篩選和病毒相互作用的宿主蛋白，驗(yàn)證已知蛋白之間的相互作用，揭示病毒的生理過程蛋白質(zhì)組研究藥物研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)研究

篩選不同受體、蛋白激酶、磷酸化酶、細(xì)胞骨架蛋白以及參與細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生的蛋白質(zhì)等

篩選與來源于腫瘤、細(xì)菌及病毒的蛋白間相互作用的多肽類藥物，確定藥物互作蛋白在腫瘤、細(xì)菌及病毒中的位置，有目標(biāo)性地干擾疾病蛋白的表達(dá)5賽爾生物酵母單、雙雜交技術(shù)服務(wù)Part酵母單、雙雜交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)2143