法醫(yī)學(xué)非人源生物檢材種屬鑒定技術(shù)規(guī)范

1法醫(yī)學(xué)非人源生物檢材種屬鑒定技術(shù)規(guī)范3.1下列術(shù)語和定義適用于本文件?，F(xiàn)對植物、動物和微生物進(jìn)行分類地位（科、屬、種）3.2參考序列referencese3.3測序序列對應(yīng)的物種基因組序列。生物體一段公認(rèn)的能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的D4縮略語BOLD：生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（TheBarcodeofLifeDataSystem）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAciNCBI：美國國立生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactTm：熔解溫度（MeltingTemperat26.1鑒定機(jī)構(gòu)應(yīng)具有從事法醫(yī)物證的執(zhí)業(yè)范圍，且應(yīng)滿足以下要求：c)具有能識別樣本的標(biāo)識系統(tǒng)，并確保樣本在鑒定過程期間能得到持續(xù)的識別；6.4實驗室的基本要求以及樣本管理、設(shè)備管理、質(zhì)量管理等DNA樣本的PCR擴(kuò)增宜設(shè)置2個重復(fù)（DNA樣本量允許的情況下），PCR過程中應(yīng)同步設(shè)置陰性模板對7.2采樣生理鹽水或磷酸緩沖液中，振蕩混勻后采用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行DNA的提取。含有自溶酶的動物組織樣本檢材DNA宜采用熒光定量試劑盒進(jìn)行定量。具體操作步驟應(yīng)按照相應(yīng)的試劑盒說明書及儀器使用指3宜采用DNA條形碼通用引物進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。推薦用于法醫(yī)學(xué)檢材種屬鑒定的通用引物信息見引物序列（5’～3’）COIF-CACAAAGACATTGGCACCCT641R-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA16SrRNAF-CGCCTGTTTATCAAAAACAT589～632R-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT12SrRNAF-GCTTCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT413～461R-TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGTrbcLF-CCATTYATGCGTTGGAGAGATCG733～734R-TCAGGACTCCACTTACTAGCTTCACGpsbA-trnHF-GTTATGCATGAACGTAATGCTC291～559R-CGCGCATGGTGGATTCACAATCCtrnLF-AGCTGTTCTAACAAATGGAGTTG268～337R-GGACTCTATCTTTGTTCTCGTCCa給出的數(shù)據(jù)為NCBI數(shù)據(jù)庫（/）現(xiàn)有物種在目標(biāo)區(qū)域的產(chǎn)物片段大小，該數(shù)據(jù)在不同物種之間存在差異。應(yīng)選用合適的PCR擴(kuò)增試劑盒和PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。具體操作應(yīng)按照試劑盒說明書和儀器體系見表2，推薦PCR擴(kuò)增程序見表3。若采用已發(fā)表文獻(xiàn)或?qū)嶒炇易孕性O(shè)計并驗證過的其它通用引物或物種特異性引物，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整PCR擴(kuò)增體系及PCR擴(kuò)增55無核酸酶水1步驟溫度℃循環(huán)數(shù)1﹣2Tma310minc﹣a應(yīng)根據(jù)目標(biāo)區(qū)域片段選擇合適的Tm。對應(yīng)表1中的目標(biāo)區(qū)域，Tm宜為：COI（53℃)、16SrRNA（53℃)、12SrRNA（60℃)、rbcL（53℃)、psbA-trnH（53℃)、trnL（57℃)。b根據(jù)目標(biāo)區(qū)域片段的實際大小、測序引物的Tm值，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)可進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。c根據(jù)目標(biāo)區(qū)域片段的實際大小、測序引物的Tm值，延伸時間可進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。4根據(jù)目標(biāo)區(qū)域片段大小采用合適濃度的瓊脂糖凝膠對7.4.2中PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，在條帶單一帶，應(yīng)通過切膠將目的條帶分離出來，隨后選純化PCR產(chǎn)物的OD260nm/OD280nm值宜在1.6～2.0之間。7.6PCR產(chǎn)物測序?qū)⒒厥债a(chǎn)物在基因測序儀上進(jìn)行雙向Sanger測序，具體操作應(yīng)按照儀器使用指南進(jìn)行。若PCR產(chǎn)物7.7結(jié)果分析7.7.2宜從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相7.7.3應(yīng)根據(jù)相似度和聚類情況綜合判斷檢材的8.1檢材測序序列與數(shù)據(jù)庫參考序列相似度不小于90%的情況下，且與相似度最高的物種同一屬內(nèi)某見可表述為“傾向于支持XX檢材來源于軟骨魚綱（Chondricht9鑒定文書5[1]InoueJG,MiyaMteleosteanphylogeny:resolvinghigher-levelrelationshipswithlongerDNAsequences.MolPhylogenetEvol.2001,20(2):275[2]KocherTD,ThomasWK,MeyerA,EdwardsSconservedprimers.ProcNatlAca