藥分三部分高效液相色譜

高效液相色譜

Highperformanceliquidchromatography,HPLC基本概念基本分類或模式HPLC的特點(diǎn)基本組成基本內(nèi)容

HPLC液相色譜流程圖PUMPDetectorW泵分離柱檢測(cè)器進(jìn)樣閥采用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。適用對(duì)象：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化樣品一、概述分析對(duì)象流動(dòng)相差別GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，占有機(jī)物的20%惰性氣體HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，占有機(jī)物的80%液體，種類較多，選擇余地廣HPLC與GC區(qū)別一、概述HPLC&經(jīng)典LC參數(shù)經(jīng)典HPLC內(nèi)徑,cm1-5~0.4長(zhǎng)度，cm50-10015-30填料粒度，um150-2003-7操作壓力,atm1-1050-200分離時(shí)間0.5h-day~10

三高

一廣

一快由于液體與氣體性質(zhì)的以下差異：溶質(zhì)在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比它在氣體中小105倍左右液體粘度比氣體約大102倍液體表明張力比氣體大104倍左右液體密度比氣體約大103倍液體不可壓縮二、影響分離的因素二、影響分離因素H=A+B/u+Cuλ↓球形固定相，高壓、勻漿裝柱法dp↓選粒徑小的化學(xué)鍵合相C↓

選粘度小、低流速的流動(dòng)相最佳線速度大內(nèi)徑柱的優(yōu)勢(shì)柱外效應(yīng)又稱柱外譜帶擴(kuò)展，是指色譜柱之外的造成色譜峰展寬的因素。是指從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測(cè)池之間除柱子本身以外的所有死空間。主要由進(jìn)樣裝置、檢測(cè)池及它們與柱之間的連接管路所產(chǎn)生,盡可能地減小柱外效應(yīng)也是HPLC儀器制造技術(shù)革新的不斷追求實(shí)驗(yàn)表明進(jìn)樣閥引起的柱效增加效果非常顯著,柱外死體積減小后柱效增加134倍、分離度提高116倍

2柱外＝2進(jìn)樣+

2連接管+

2接頭+

2檢測(cè)池+

2其它中心進(jìn)樣池體積匹配柱外效應(yīng)標(biāo)志？比例因子X1/X2=(D1/D2)2D-columndiameterXstandsforflowrate,

thevolumeofflowcell流動(dòng)相為有機(jī)相流動(dòng)相為緩沖溶液分析對(duì)象不同分離機(jī)制：疏溶劑理論等固定相：非極性鍵合相 如:十八烷基硅烷鍵合相（ODS；C18柱)流動(dòng)相：極性流動(dòng)相 如:甲醇-水或乙腈-水或四氫呋喃－水樣品極性與k的關(guān)系:極性↑，保留時(shí)間↓應(yīng)用范圍：非極性--中等極性組分(80%)反相色譜(RP-HPLC)反相色譜RPLC固定液極性<流動(dòng)相極性極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱分離機(jī)制：定向作用力、誘導(dǎo)作用力、或氫鍵作用力的差別固定相：極性固定相如氰基或氨基流動(dòng)相：非極性溶劑（如正己烷）+極性調(diào)節(jié)劑（乙醇、四氫呋喃）流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：

流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓結(jié)構(gòu)相近組分，極性大的組分后出柱應(yīng)用范圍：極性組分(20%)正相鍵合相色譜法(NP-HPLC)正相色譜NPLC固定液極性>流動(dòng)相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱HPLC流動(dòng)相選擇原則保持色譜柱的穩(wěn)定性化學(xué)惰性適合所用的檢測(cè)器對(duì)樣品有一定的溶解能力清洗、更換方便、毒性小沸點(diǎn)、粘度等物理性質(zhì)合適HPLC流動(dòng)相正相洗脫 流動(dòng)相的極性小于固定相的洗脫反相洗脫 流動(dòng)相的極性大于固定相的洗脫洗脫方式：等度洗脫(isocraticelution)恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫(gradientelution)在一個(gè)分析周期內(nèi)不斷改變流動(dòng)相的比例裝置：

高壓梯度：用兩臺(tái)高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動(dòng)相輸入到色譜柱中。梯度洗脫法優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度HPLC主要部件高壓輸液泵進(jìn)樣閥

色譜柱檢測(cè)器HPLC主要部件(1)高壓輸液泵恒壓恒流主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。(2)進(jìn)樣閥

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：進(jìn)樣閥作用是將微量樣品注入高壓流動(dòng)相中（3）分離系統(tǒng)——色譜柱對(duì)色譜柱要求高效液相色譜：硅膠和化學(xué)鍵合硅膠（C18，CN，苯基）離子色譜：離子交換填料分子排阻色譜：凝膠或高分子多孔小球色譜柱是HPLC的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。色譜裝填得好壞（填充密度）對(duì)柱效影響很大。分離系統(tǒng)——色譜柱色譜柱是HPLC的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料主要是不銹鋼。一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4.6mm。分離系統(tǒng)——色譜柱固定相篩板：能夠使液體通過而阻止固定相移動(dòng)硅膠可耐高壓、耐有機(jī)溶劑和水溶液易于引入多種官能團(tuán)表面性質(zhì)已被充分認(rèn)識(shí)

缺陷：可承受的pH范圍有限（2-8）聚合物可承受的pH范圍廣（1-14）柱效低（小分子）遇有機(jī)溶劑易溶脹基質(zhì)類型化學(xué)鍵合反相固定相目前應(yīng)用最廣泛的一類固定相常見類型C18、C8Si-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-SiSi-O-Si-O-SiSi-O-Si檢測(cè)器－色譜系統(tǒng)的眼鏡紫外檢測(cè)器（通用型、較高靈敏度）熒光檢測(cè)器（選擇性、高靈敏度）示差檢測(cè)器（通用型、低靈敏度）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（通用型、較高靈敏度）質(zhì)譜檢測(cè)器（通用型、高靈敏度）液相色譜檢測(cè)器

a.紫外檢測(cè)器

特點(diǎn)：適用范圍廣、靈敏度較高、線形范圍較寬、對(duì)操作條件不敏感（流速、溫度變化）可用于梯度洗脫

流通池類型基本原理：朗伯比耳定律紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。液相色譜檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器

（refractiveindexdetector）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值與濃度呈正比特點(diǎn)：通用型靈敏度低對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫R=z(n-n0)

溶劑折光指數(shù)（RI）溫度水1.33320℃丙酮1.35820℃乙烷1.37520℃乙醇1.36218℃四氟呋喃1.40425℃乙二醇1.42720℃氯仿1.44618℃四氯化炭1.46315℃甲苯1.49620℃苯1.50120℃甲醇1.328620℃四氯化炭1.460320℃

熒光檢