第六章 植物的離體微繁

第六章植物的離體微繁植物離體微繁的概念和發(fā)展植物離體微繁的一般方法試管苗增殖率的估算及實(shí)際可能性影響離體微繁的因素離體微繁中存在的主要問(wèn)題試管微莖無(wú)糖微繁技術(shù)植物離體微繁的應(yīng)用6.1植物離體微繁的概念和發(fā)展

6.1.1植物離體微繁的概念

又稱微體繁殖、試管繁殖或離體繁殖，是指利用植物組織培養(yǎng)方法對(duì)分離的植物外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，通過(guò)誘導(dǎo)外植體的增殖在短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生個(gè)體的技術(shù)。月季叢芽6.1.2植物離體微繁的發(fā)展

1960年，Morel和Martin建立了蘭花微繁增殖的體系?？墒挂粋€(gè)蘭花莖尖在一年內(nèi)生產(chǎn)出400萬(wàn)株在遺傳性上和母本植株完全相同的蘭花植株，開(kāi)創(chuàng)了組織培養(yǎng)法進(jìn)行植物快速繁殖的先例。1958年，Wickson和Thimann利用莖尖培養(yǎng)得到微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。

以上四人的研究建立了植物試管微繁研究與利用的基礎(chǔ)，這一技術(shù)不僅是對(duì)蘭花種植業(yè)的革命，而且開(kāi)辟了利用莖尖培養(yǎng)法快速繁殖其它重要植物的新途徑。金絲桃1982年Kim首先報(bào)道了馬鈴薯試管微薯的誘導(dǎo)方法，PilarTovar（1985）、RolandoLizarrage（1989）也報(bào)道了這方面的工作，試管微薯的誘導(dǎo)為利用地下莖繁殖的植物的微繁殖開(kāi)創(chuàng)了另一個(gè)新途徑。20世紀(jì)80年代末，日本千葉大學(xué)Kozal教授發(fā)明了無(wú)糖微繁技術(shù)?？梢詫?shí)現(xiàn)幼莖的生根及胚狀體的分化等目的。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，從20世紀(jì)60年代至今，人們已用各種微繁技術(shù)成功培育了1226個(gè)屬的2776種植物，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的許多重要花卉已基本實(shí)現(xiàn)試管產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)。6.1.3植物離體微繁的特點(diǎn)（1）繁殖效率高；（2）占用空間少；（3）微繁培養(yǎng)條件可控性強(qiáng)，不受季節(jié)和災(zāi)害性氣候的影響；（4）管理方便，同時(shí)便于種質(zhì)的保存和交換。6.2植物離體微繁的一般方法

6.2.1植物離體微繁的過(guò)程五個(gè)階段無(wú)菌培養(yǎng)物的建立誘導(dǎo)中間繁殖體的生長(zhǎng)與分化中間繁殖體的增殖試管苗的壯苗和生根試管苗的出瓶移栽與管理6.2.1.1無(wú)菌培養(yǎng)物的建立6.2.1.2中間繁殖體的生長(zhǎng)與分化四種方式供體植株選擇外植體取樣和表面滅菌接種與培養(yǎng)頂芽和腋芽的發(fā)育

不定芽的發(fā)育體細(xì)胞胚的發(fā)生與發(fā)育A切取外植體；B形成的原球莖原球莖的發(fā)育6.2.1.3中間繁殖體的增殖地靈（左）和蘆薈（右）增殖（陳耀鋒，2001）香蕉試管苗.脫毒馬鈴薯

6.2.1.4壯苗與生根

葡萄試管苗壯苗生根（左）及煉苗（右）（陳耀鋒，1996）在此階段多采用1／2或1／4的MS培養(yǎng)基，全部去掉或僅用很低濃度的細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長(zhǎng)素（如NAA、IAA和IBA等）試管內(nèi)生根或壯苗，減少培養(yǎng)基中糖含量（一半）和提高光照強(qiáng)度（提高到1000～3000Lx或5000Lx）。使它們減少對(duì)異養(yǎng)條件的依賴，逐步提高其光合自養(yǎng)能力，同時(shí)，試管苗出瓶前應(yīng)打開(kāi)瓶口煉苗3～5d。6.2.1.5試管苗出瓶移植與管理必須注意：（1）保持試管苗出瓶后的水分平衡。（2）選擇疏松通氣、易消毒處理的栽培介質(zhì)。（3）防止移植介質(zhì)及周邊環(huán)境中菌類滋生。（4）加強(qiáng)光照與溫度管理。蛭石粗沙珍珠巖鋸木屑樹(shù)皮取樣，表面消毒，接種，污染和褐變檢查分化再生順利，標(biāo)志第二階段完成；迅速增殖，繁殖體積累，標(biāo)志第三階段完成選定植物材料查閱文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)培養(yǎng)基供體植株選擇和處理無(wú)菌培養(yǎng)物建立繼代成功，標(biāo)志無(wú)菌培養(yǎng)的建立，第一階段完成中間繁殖體分化、再生與增殖壯苗和生根馴化或移植，幼苗期管理、成活移栽或插植成活，標(biāo)志第五階段完成生根順利，標(biāo)志第四階段完成盆栽、地植、銷售試管微繁程序簡(jiǎn)圖6.3試管苗增殖率的估算及實(shí)際可能性6.3.1繁殖系數(shù)繁殖系數(shù)（propagationcoefficient）：是指在一次繼代培養(yǎng)中由一個(gè)苗（芽或芽叢）得到新苗的個(gè)數(shù)。

T（繁殖系數(shù)）=Nt（繁殖得到的新苗數(shù)）／N0（原有苗數(shù)）連續(xù)培養(yǎng)若干代，分別算出各代的繁殖系數(shù)，再求其平均值。6.3.2繁殖速度和增殖倍數(shù)

繁殖速度（propagationvelocity）是指在一段時(shí)間（例如一年）內(nèi)由一個(gè)苗經(jīng)幾代連續(xù)繁殖得到的新苗數(shù)。如將N0個(gè)苗，連續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，其繁殖系數(shù)為t，各次培養(yǎng)所得的苗數(shù)應(yīng)為：第一代培養(yǎng)得苗數(shù)為：N1＝N0×t＝N0t第二代培養(yǎng)得苗數(shù)為：N2＝N1×t＝N0t2

同樣，第三代得苗數(shù)為：N3=N1×t=N0t3則第n代培養(yǎng)得苗數(shù)為：Nn=N0tn又設(shè)：N＝Nn／N0則有N＝tn。這里N即可定義為：經(jīng)過(guò)n代培養(yǎng)后試管苗的增殖倍數(shù)。“連續(xù)繁殖”，是指每一次均將前一次培養(yǎng)所得的全部苗用于再繁殖。如葡萄，繁殖系數(shù)4，一年繁殖10代，則有：

N＝

tn=410=1048576即在一年內(nèi)苗增殖1百萬(wàn)倍以上。6.3.3有效繁殖系數(shù)和實(shí)際增殖倍數(shù)

第一次培養(yǎng)由一個(gè)苗得到t個(gè)苗，在進(jìn)行第二代培養(yǎng)時(shí)，取出數(shù)量為a的苗做生根之用，而僅用t-a＝k的苗進(jìn)行再繁殖；k即為有效繁殖系數(shù)，a可稱為誘導(dǎo)生根苗指數(shù)；以后一直保持k為有效繁殖系數(shù)，即取數(shù)量為k的苗用于再繁殖，其余轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)n代培養(yǎng)后，繁殖產(chǎn)生的苗總數(shù)Pn＝N0·（t-a）n=N0·Kn。令P=Pn／N0=Kn，P即可稱之為實(shí)際繁殖速度或?qū)嶋H增殖倍數(shù)。6.3.4苗木的產(chǎn)率繁殖后的試管苗，須經(jīng)生根、移栽成活、成為商品苗階段。如果用fr代表誘導(dǎo)生根率，fv代表移栽成活率，fe代表商品苗占全部移栽成活苗的百分率，

則f＝fr×fv×fe，f即為從誘導(dǎo)生根苗得到合格商品苗的百分率?？煞Q之為繁殖效率由一個(gè)苗所得的用于誘導(dǎo)生根的全部苗總量定為M，這個(gè)繁殖體系中的苗木產(chǎn)量率定為S，則S=M×f。6.4影響離體微繁的因素

基因型外植體：用于快繁的主要有幼葉、莖尖分生組織、種子、鱗莖、球莖、根莖、花序、莖段等。供試植株的生理狀態(tài)芽在植株上的部位供試植株的年齡培養(yǎng)基培養(yǎng)條件極性后生變異：離體培養(yǎng)形成的小植株在培養(yǎng)時(shí)受到的影響，可能會(huì)繼續(xù)影響移植到自然環(huán)境中的植株生長(zhǎng)，產(chǎn)生一定的變異。6.5離體微繁中存在的主要問(wèn)題6.5.1褐變

與菌類污染和玻璃化一起被稱為組織培養(yǎng)中的三大障礙。原因：材料的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分、外植體大小、人為切割等?？朔拇胧哼x擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w和培養(yǎng)條件、抗氧化劑和抑制劑的作用、連續(xù)轉(zhuǎn)移和預(yù)處理。6.5.2玻璃化

試管苗玻璃化（vitrification）是指組織培養(yǎng)過(guò)程中的特有的一種生理失調(diào)或生理病變，試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。6.5.2.1玻璃化苗的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)特征

形態(tài)上，水漬化呈半透明狀，植株矮小腫脹，莖尖頂端分生組織相對(duì)較小，保持分生組織特性的時(shí)期也縮短，節(jié)間短或幾乎沒(méi)有，葉表面縮小或增大，葉片常皺縮并縱向卷曲，脆弱易破碎，其顏色不正常。八寶景天正常苗八寶景天玻璃化苗顯微學(xué)觀察表明，玻璃化苗一般莖皮層及髓部的薄壁組織過(guò)度伸長(zhǎng)、細(xì)胞間隙大、輸導(dǎo)組織發(fā)育不良或畸形，導(dǎo)管和管胞木質(zhì)化不完全。葉片柵欄組織細(xì)胞層數(shù)減少，或僅有海綿組織，葉肉細(xì)胞間隙大。車輪棠玻璃化與正常芽和葉片顯微結(jié)構(gòu)的對(duì)比6.5.2.2玻璃化苗的生理生化特點(diǎn)

細(xì)胞中含水量高，葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等含量較低。牛自勉等研究發(fā)現(xiàn)蘋果玻璃化苗的葉片及莖尖中GA3、IAA、ABA含量極顯著上升，而CTK含量則顯著下降。hyperhydricityinOreopanax（及山參屬）

nymphaefolia6.5.2.3影響試管苗玻璃化的因素外植體：外植體類型及大小培養(yǎng)的環(huán)境條件：光照、溫度、濕度、pH值。培養(yǎng)基成分：Ms培養(yǎng)基是控制玻璃化發(fā)生較理想的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中增加K、P、Fe、Ca、Mn、Zn元素的含量，降低B含量，增加硝態(tài)氮，降低銨態(tài)氮，可起到降低玻璃化率的作用?，斂?.5.2.4玻璃化苗的綜合控制

選擇合適的外植體：玻璃化苗絕大多數(shù)為來(lái)自莖尖或莖切段培養(yǎng)物的不定芽。改善培養(yǎng)基組成：適當(dāng)降低培養(yǎng)基中NH4+濃度，適當(dāng)添加IAA、GA3、ABA，減少BA用量均可降低玻璃化苗的發(fā)生頻率。改善培養(yǎng)條件：適當(dāng)提高培養(yǎng)時(shí)的光照強(qiáng)度，延長(zhǎng)光照時(shí)間，降低培養(yǎng)容器內(nèi)的空氣相對(duì)濕度，改善供氧狀況，采用有透氣膜的培養(yǎng)容器等培養(yǎng)條件的改良均可以降低玻璃化苗的發(fā)生頻率。6.5.3遺傳的穩(wěn)定性實(shí)踐證明，莖尖分生組織是遺傳學(xué)上最穩(wěn)定的部分，通過(guò)頂芽和腋芽繁殖途徑進(jìn)行增殖是最能保持原品種優(yōu)良特性的繁殖方式.變異的白花貝母蘭白花貝母蘭組培苗6.5.4污染6.5.4.1來(lái)源：植物材料本身（表面、內(nèi)生菌）；在無(wú)菌操作和培養(yǎng)過(guò)程中由外界環(huán)境

進(jìn)入培養(yǎng)容器而引起的。6.5.4.2污染的癥狀：

2～3d產(chǎn)生菌落——表面滅菌不徹底；3～5d后陸續(xù)產(chǎn)生——內(nèi)生菌所致。6.5.4.3污染所引起的危害：引起早期培養(yǎng)的失敗，試管苗生長(zhǎng)速度減慢、生活力下降、增殖效率降低、玻璃苗增加及生長(zhǎng)不均勻、葉片失綠甚至死亡等；在后期導(dǎo)致試管苗移栽困難和死亡；污染也會(huì)引起培養(yǎng)物的遺傳變異。6.5.4.4

污染的防止

供體材料的選擇：盡可能使用溫室和人工氣候條件中培養(yǎng)的健康、無(wú)病蟲(chóng)害植物作材料。培養(yǎng)物的檢測(cè)：特別要注意培養(yǎng)物和培養(yǎng)基接觸的部分。合理的擴(kuò)繁殖程序：將最初的無(wú)菌培養(yǎng)物中一部分作為“原原種”進(jìn)行專門保存，分批繁殖和復(fù)檢后再進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。嚴(yán)格無(wú)菌操作規(guī)程6.5.4.5已污染培養(yǎng)物的處理抗菌素：弄清楚要抑制菌的種類；使用的抗生素是否對(duì)培養(yǎng)的植物組織有不良影響；還要確立抗生素的使用濃度、處理時(shí)間的長(zhǎng)短。希望采取一些措施恢復(fù)無(wú)菌狀態(tài)，方法之一是使培養(yǎng)物在試管內(nèi)長(zhǎng)成小植株后移栽，待它生長(zhǎng)成健壯的幼苗后再重新消毒接種。另一種方法在一個(gè)較大的容器中生長(zhǎng)，適當(dāng)降低容器中的相對(duì)濕度，待植株長(zhǎng)到一定高度后取較大的莖尖重新消毒接種，但這種方法對(duì)已污染的愈傷組織和有內(nèi)生菌的材料將不起作用。6.6試管微莖6.6.1試管微莖的概念試管微莖（microstem）是利用植物細(xì)胞全能性原理，在離體培養(yǎng)條件下，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的調(diào)整，誘導(dǎo)植物的離體組織或試管苗在容器內(nèi)形成微型變態(tài)莖的植物離體培養(yǎng)技術(shù)。百合試管小鱗莖、半夏試管莖、魔芋試管微球莖、郁金香試管鱗莖、馬蹄蓮試管塊莖、懷山藥試管塊莖、芋試管球莖、試管姜等相繼誘導(dǎo)成功。變態(tài)莖6.6.2試管微莖的意義

試管微莖的意義在于與試管苗相比具有幾個(gè)重要的特點(diǎn)：（1）試管微莖可以由脫毒苗形成，具有試管微繁的所有特點(diǎn)，同時(shí)更方便運(yùn)輸；（2）利用試管微繁技術(shù)誘導(dǎo)試管莖，對(duì)于深入研究試管莖的形成、發(fā)育和調(diào)控機(jī)理，揭示植物地下莖形成機(jī)制等都具有十分重要的意義；（3）試管微莖是進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體。6.6.3試管微莖誘導(dǎo)的一般方法液體培養(yǎng)體系固液雙層培養(yǎng)體系固體直接誘導(dǎo)培養(yǎng)體系液體和固液雙層培養(yǎng)體系誘導(dǎo)培養(yǎng)60d，固體直接誘導(dǎo)培養(yǎng)30d后，可以獲得試管微薯。6.6.4影響試管微莖發(fā)生的因素

外植體培養(yǎng)基：提高培養(yǎng)基中P和K、Ca的供應(yīng)比例有利于提高試管莖產(chǎn)量；在原MS基礎(chǔ)上將錳增加1倍，鐵和銅增加0.5倍可顯著提高馬鈴薯試管薯的產(chǎn)量和品質(zhì)（李會(huì)珍，2003）。激素：主要有6BA、NAA、IAA、BAP、CCC、SA和多效唑等。糖的種類和濃度：大多以蔗糖為碳源，濃度30～90g/L溫度和光照：荸薺在18℃時(shí)形成的試管球莖數(shù)最多，鮮重最大；馬鈴薯在誘導(dǎo)結(jié)薯階段溫度為18～20℃。馬鈴薯莖段在固體MS培養(yǎng)基（MS十3%蔗糖+0.8%瓊脂）中培養(yǎng)21d（光強(qiáng)2000Lx、光周期16h/d、25士1℃）后，轉(zhuǎn)入液體誘導(dǎo)結(jié)薯培養(yǎng)基（MS+5mg/LBA十500mg/LCCC+8%蔗糖），全