有助于改善骨密度檢驗(yàn)方法

有助于改善骨密度檢驗(yàn)方法有助于改善骨密度作用檢驗(yàn)方法根據(jù)受試樣品作用原理的不同，分為方案一（補(bǔ)鈣為主的受試物）和方案二（不含鈣或不以補(bǔ)鈣為主的受試物）兩種。1方案一1.1實(shí)驗(yàn)原理機(jī)體中的鈣絕大部分儲(chǔ)存于骨骼及牙齒中，大鼠若攝入鈣量不足會(huì)影響機(jī)體和骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)為體重，身長(zhǎng)，骨長(zhǎng)，骨重，骨鈣含量及骨密度低于攝食足量鈣的正常大鼠。生長(zhǎng)期大鼠在攝食低鈣飼料的基礎(chǔ)上分別補(bǔ)充碳酸鈣（對(duì)照組）或受試含鈣產(chǎn)品（實(shí)驗(yàn)組比較兩者在促進(jìn)機(jī)體及骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，增加骨礦物質(zhì)含量和增加骨密度功能上的作用，從而對(duì)受試樣品有助于改善骨密度的功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。1.2儀器和試劑1.2.1儀器：原子吸收分光光度計(jì)、骨密度儀（雙能X線骨密度儀、或單光子骨密度儀或相關(guān)儀器）、精密卡尺、動(dòng)物解剖器械、動(dòng)物天平、105℃烘箱。1.2.2硝酸，優(yōu)級(jí)純高氯酸，優(yōu)級(jí)純氧化鑭，2%氧化鑭溶液稱取分析純氧化鑭（含量大于99.99%）25克，加75mL優(yōu)級(jí)純鹽酸，加去離子水至1000mL。鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取1.2486克分析純碳酸鈣（純度大于99.99%加50mL去離子水，加鹽酸使之溶解。移入1000mL容量瓶中，加2%氧化鑭溶液至刻度。此溶液1.00mL相當(dāng)于500μg鈣。儲(chǔ)于聚乙烯瓶中，4℃保存，臨用時(shí)稀釋。1.3實(shí)驗(yàn)方法出生4周左右的斷乳大鼠，體重約60－75克，同一性別，每組8－12只。1.3.2基礎(chǔ)飼料：用此基礎(chǔ)飼料配制低鈣對(duì)照組以及各劑量組。表1基礎(chǔ)飼料配方（Ca2+計(jì)，調(diào)整Ca2+為150mg/100g飼料）成分%酪蛋白黃豆粉小麥面粉54.0玉米油或花生油4.0纖維素2.0混合鹽2.6混合維生素氯化膽堿0.2DL－蛋氨酸0.2淀粉需高壓處理后用混合鹽：每kg混合鹽中各組份含量：KH2PO4，501.4g；NaCl，74.0g；MgCO3，50.2g；乳酸亞鐵，5.4g；加蔗糖到1kg?；旌暇S生素：每kg混合維生素中各組份含量：維生素A，400,000IU；維生素D3，100,000IU；維生素E，500IU；維生素K，5mg；維生素B1，600mg；維生素B2，600mg；維生素B6，700mg；維生素B12，1mg；尼克酸，3g；葉酸，200mg；泛酸鈣，1.6g；生物素，20mg；加蔗糖到1kg。可根據(jù)各組待測(cè)受試物（或碳酸鈣）的需用量調(diào)節(jié)淀粉用量。1.3.3劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組，以人體推薦量的5倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)一個(gè)低鈣對(duì)照組（150mg/100g飼料）和與相應(yīng)劑量受試物鈣水平相同的碳酸鈣對(duì)照組（如僅設(shè)一個(gè)碳酸鈣對(duì)照組，推薦設(shè)立與高劑量鈣水平相同的碳酸鈣對(duì)照組）。用低鈣對(duì)照組（150mg/100g飼料）飼料配制受試樣品各劑量組和碳酸鈣對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間3個(gè)月。1.3.4受試物給予途徑經(jīng)口灌胃給予受試物，無法灌胃時(shí)將受試物摻入飼料，并記錄每只動(dòng)物的飼料攝入量。1.3.5實(shí)驗(yàn)步驟出生4周的斷乳大鼠經(jīng)適應(yīng)期一周后，禁食12小時(shí)，稱體重，按體重隨機(jī)分組，分籠飼養(yǎng)。飲用去離子水以避免從飲水中獲得鈣。1.4觀察指標(biāo)1.4.1體重測(cè)定：禁食12小時(shí)后，測(cè)定體重。每周一次。1.4.2股骨重量測(cè)定:動(dòng)物喂養(yǎng)3個(gè)月后處死，剝離出右側(cè)股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，稱量骨干重。1.4.3股骨骨密度測(cè)定:用骨密度儀雙能X線骨密度儀、或單光子骨密度儀或相關(guān)儀器）測(cè)量股骨中點(diǎn)及股骨遠(yuǎn)心端的骨密度。1.4.3.1在股骨遠(yuǎn)心端及股骨中點(diǎn)畫出標(biāo)記以確定測(cè)量點(diǎn)。股骨中點(diǎn)測(cè)量點(diǎn)的確定：測(cè)量股骨全長(zhǎng)，通過其中點(diǎn)，沿橫截面方向畫一直線，此為股骨中點(diǎn)測(cè)量點(diǎn)（截股骨遠(yuǎn)心端測(cè)量點(diǎn)的確定：于股骨遠(yuǎn)心端關(guān)節(jié)凹槽最下緣處確定測(cè)量點(diǎn)，通過此點(diǎn)，畫一與上述股骨中點(diǎn)處標(biāo)記平行的直線，此為股骨遠(yuǎn)心端測(cè)量點(diǎn)（截面）。1.4.3.2測(cè)量前用骨模型對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。1.4.3.3經(jīng)校準(zhǔn)可以使用后，繼續(xù)測(cè)定骨模型并與其標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，誤差不得超過3%。1.4.3.4雙能X線骨密度儀或單光子骨密度儀參數(shù)設(shè)定：測(cè)定方式：精密掃描次數(shù)：2次掃描方式：自動(dòng)探測(cè)域值：99%1.4.3.5測(cè)量股骨中點(diǎn)及股骨遠(yuǎn)心端骨密度。將待測(cè)骨放置于測(cè)量臺(tái)上與骨密度儀探測(cè)頭移動(dòng)方向垂直；移動(dòng)待測(cè)骨，令其待測(cè)點(diǎn)標(biāo)記線與探測(cè)頭移動(dòng)軌跡于測(cè)量臺(tái)上的垂直投影重合。開始測(cè)量，每點(diǎn)應(yīng)重復(fù)測(cè)定兩次，如兩次結(jié)果不平行（誤差大于10%應(yīng)當(dāng)重新測(cè)量。將兩次結(jié)果取平均值，以BW（骨寬）除BMC（骨礦物質(zhì)含量其結(jié)果即為BMD（骨密度）。1.4.4骨鈣含量及飼料含鈣量測(cè)定：用原子吸收法測(cè)量。1.4.4.1樣品采集與制備1.4.4.1.1飼料樣品經(jīng)均勻混合并過20目篩，在烘箱中烘干，置干燥器中冷卻后稱重，磨細(xì)。注意防止在樣品制備過程中的污染。1.4.4.1.2取大鼠一側(cè)股骨在105℃烘箱中烘干至恒重后，置于三角瓶中進(jìn)行消化。1.4.4.2樣品消化根據(jù)樣品中鈣的含量，準(zhǔn)確稱取0.300~1.00克，置于150mL三角瓶中，上蓋小漏斗，加入混合酸（硝酸：高氯酸=4：1）15~20mL，在電熱板上加熱消化直至冒白煙并透明無色。酸液不夠時(shí)可以再加入少量混合酸。消化液透明無色后加數(shù)毫升去離子水，煮沸以趕除剩余的酸，重復(fù)兩次，最后消化液的體積不超過1mL。消化樣品時(shí)應(yīng)同時(shí)作空白試驗(yàn)，加入與樣品消化時(shí)相同體積的混合酸，在相同條件下消化。1.4.4.3測(cè)定按照原子吸收分光光度計(jì)儀器說明書的步驟進(jìn)行。測(cè)定液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白均用0.5%氧化鑭溶液稀釋，定容。1.5數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果判定骨鈣含量或骨密度顯著高于低鈣對(duì)照組且不低于相應(yīng)劑量碳酸鈣對(duì)照組，鈣的吸收率不低于碳酸鈣對(duì)照組，可判定受試物具有有助于改善骨密度的作用。2方案二2.1實(shí)驗(yàn)原理雌性成年大鼠切除卵巢后，骨代謝增強(qiáng)，并發(fā)生骨重吸收（破骨）作用大于骨生成（成骨）作用的變化。這種變化表現(xiàn)為骨量丟失，經(jīng)過一定時(shí)間的積累，可以造成骨密度降低模型。在建立模型的同時(shí)或模型建立之后給模型實(shí)驗(yàn)組大鼠補(bǔ)充受試樣品，通過受試物抑制破骨或促進(jìn)成骨等骨代謝調(diào)節(jié)作用，觀察其在增加骨密度功能及骨鈣含量的效果，從而對(duì)受試樣品有助于改善骨密度的功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar或SD雌性大鼠，300克左右，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周。2.3飼料配方參照AIN93飼料配方配制半成品飼料，用適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)替換飼料中來源于大豆的成分，以避免大豆異黃酮等植物雌激素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。參考配方見下表。表2參考飼料配方成分含量（%）酪蛋白23DL-蛋氨酸0.3玉米淀粉32蔗糖30纖維5玉米油5混合礦物鹽13.5混合維生素21二酒石酸膽堿0.21.25×104。2含有（/kg飼料VitA1.4×104IU，VitD1，500IU，VitE120mg，VitK3mg，VitB112mg，VitB220mg，VitB612mg，VitB120.03mg，煙酸60mg，泛酸24mg，葉酸6mg，生物素0.54mg。2.4儀器和試劑2.4.1儀器：原子吸收分光光度計(jì)、雙能X線骨密度儀、單光子骨密度儀、精密卡尺、動(dòng)物解剖器械、動(dòng)物天平、105℃烘箱。2.4.2試劑硝酸，優(yōu)級(jí)純高氯酸，優(yōu)級(jí)純氧化鑭，2%氧化鑭溶液稱取分析純氧化鑭（含量大于99.99%）25g，加75mL優(yōu)級(jí)純鹽酸，加去離子水至1000mL。鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取1.2486g分析純碳酸鈣（純度大于99.99%加50mL去離子水，加鹽酸使之溶解。移入1000mL容量瓶中，加2％氧化鑭溶液至刻度。此溶液1.00mL相當(dāng)于500μg鈣。儲(chǔ)于聚乙烯瓶中，4℃保存，臨用時(shí)稀釋。2.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)劑量2.5.1卵巢切除術(shù)及術(shù)后篩查大鼠經(jīng)腹腔注射30mg/kgBW的戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹位固定后于腹中線距陰道口3－4cm處去毛，分別用碘酒和酒精消毒，待稍干后切開皮膚和腹肌約2－3cm，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪層找到子宮后，輕輕將一側(cè)子宮角拉出，在其末端可見被脂肪團(tuán)包裹的卵巢。分離脂肪團(tuán)，便可見到粉紅色或黃紅色的卵巢，以止血鉗夾住卵巢，然后將卵巢下輸卵管（包括脂肪）用絲線結(jié)扎，剪除卵巢（檢查是否完全剪除順勢(shì)將子宮角送回腹腔中，同法剪除另側(cè)卵巢。腹肌和皮膚分層縫合后，再次消毒。最后經(jīng)后肢肌肉注射2萬U青霉素。也可經(jīng)背部肋脊角切口行卵巢切除術(shù)。為保證手術(shù)成功，大鼠摘除卵巢后5天，進(jìn)行陰道涂片檢查（用滴管吸取少量生理鹽水，輕輕插入陰道1－2cm，沖洗數(shù)次后吸出，涂于玻片上，鏡下觀察每天一次，連續(xù)7天，以檢查大鼠卵巢是否完全摘除；如涂片呈動(dòng)情反應(yīng)（鏡下見大量半透明、扁平的表皮細(xì)胞表明動(dòng)物卵巢切除不完全，應(yīng)棄去不用。有經(jīng)驗(yàn)者可不進(jìn)行術(shù)后篩查。2.5.2動(dòng)物分組大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后分組，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分組為假手術(shù)組、切除卵巢組＋溶劑組、切除卵巢＋低劑量受試物組、切除卵巢＋中劑量受試物組、切除卵巢＋高劑量受試物組。必要時(shí)設(shè)切除卵巢＋陽性對(duì)照組（具雌激素活性的物質(zhì)）。每組動(dòng)物8－12只。2.5.3劑量分組及受試樣品給予時(shí)間如果受試物為不含鈣產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)陰性對(duì)照組，以人體推薦量的5倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組。如果受試物是不以補(bǔ)鈣為主（可少量含鈣）的產(chǎn)品，在根據(jù)成人每公斤人體推薦量設(shè)置三個(gè)劑量受試物組的基礎(chǔ)上，可再設(shè)與相應(yīng)受試物鈣水平相似的碳酸鈣對(duì)照組。（如僅設(shè)一個(gè)碳酸鈣對(duì)照組，推薦設(shè)立與高劑量鈣相同的碳酸鈣對(duì)照組。）各組動(dòng)物手術(shù)后3－5天開始灌胃給予受試物或溶劑，無法灌胃時(shí)將受試物摻入飼料，并記錄每只動(dòng)物的飼料攝入量。要考慮飼料中是否存在大豆異黃酮對(duì)結(jié)果的影響。受試物給予時(shí)間3個(gè)月。2.6觀察指標(biāo)2.6.1體重2.6.2骨鈣測(cè)定2.6.2.1樣品采集與制備取大鼠一側(cè)股骨在105℃烘箱中烘干至恒重后，稱量骨干重，置于三角瓶中進(jìn)行消化。2.6.2.2樣品消化根據(jù)樣品中鈣的含量，準(zhǔn)確稱取0.300~1.00g，置于150mL三角瓶中，上蓋小漏斗，加入混合酸（硝酸：高氯酸=4：1）15~20mL，在電熱板上加熱消化直至冒白煙并透明無色。酸液不夠時(shí)可以再加入少量混合酸。消化液透明無色后加數(shù)毫升去離子水，煮沸以趕除剩余的酸，重復(fù)兩次，最后消化液的體積不超過1mL。消化樣品時(shí)應(yīng)同時(shí)作空白試驗(yàn)，加入與樣品消化時(shí)相同體積的混合酸，在相同條件下消化。2.6.2.3測(cè)定原子吸收法或化學(xué)法測(cè)定骨鈣含量。2.6.3骨密度測(cè)定：用骨密度儀測(cè)定股骨中點(diǎn)和股骨遠(yuǎn)心端骨密度。2.6.3.1在股骨遠(yuǎn)心端及股骨中點(diǎn)畫出標(biāo)記以確定測(cè)量點(diǎn)。股骨中點(diǎn)測(cè)量點(diǎn)的確定：測(cè)量股骨全長(zhǎng)，通過其中點(diǎn)，沿橫截面方向畫一直線，此為股骨中點(diǎn)測(cè)量點(diǎn)（截股骨遠(yuǎn)心端測(cè)量點(diǎn)的確定：于股骨遠(yuǎn)心端關(guān)節(jié)凹槽最下緣處確定測(cè)量點(diǎn)，通過此點(diǎn)，畫一與上述股骨中點(diǎn)處標(biāo)記平行的直線，此為股骨遠(yuǎn)心端測(cè)量點(diǎn)（截面）。2.6.3.2測(cè)量前用骨模型對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。2.6.3.3經(jīng)校準(zhǔn)可以使用后，繼續(xù)測(cè)定骨模型并與其標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，誤差不得超過3%。2.6.3.4骨密度儀參數(shù)設(shè)定測(cè)定方式：精密掃描次數(shù)：2次掃描方式：自動(dòng)探測(cè)域值：99%2.6.3.5測(cè)量股骨中點(diǎn)及股骨遠(yuǎn)心端骨密度將待測(cè)骨放置于測(cè)量臺(tái)上與骨密度儀探測(cè)頭移動(dòng)方向垂直；移動(dòng)待測(cè)骨，令其待測(cè)點(diǎn)標(biāo)記線與探測(cè)頭移動(dòng)軌跡于測(cè)量臺(tái)上的垂直投影重合。開始測(cè)量，每點(diǎn)應(yīng)重復(fù)測(cè)定兩次，如兩次結(jié)果不平行（誤差大于10%應(yīng)當(dāng)重新測(cè)量。將兩次結(jié)果取平均值，以BW（骨寬）除BMC（骨礦物質(zhì)含量其結(jié)果即為BMD（骨密度）。2.7數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果判定不含鈣的產(chǎn)品，卵巢切除+溶劑組骨鈣含量或骨密度顯著低于假手術(shù)組，表明造成大鼠骨密度低下模型；卵巢切除+受試物組的骨鈣含量或骨密度較卵巢切除+溶劑組顯著增加，而其它指標(biāo)（體重除外）不顯著低于卵巢切除+溶劑組，可判定受試物具有有助于改善骨密度作用。不以補(bǔ)鈣為主（可含少量鈣）的產(chǎn)品，卵巢切除+溶劑組骨鈣含量或骨密度顯著低于假手術(shù)組，表明造成大鼠骨密度低下模型；卵巢切除+受試物組的骨鈣含量或骨密度較卵巢切除+溶劑組顯著增加，且不低于相應(yīng)劑量的CaCO3對(duì)照組，而其它指標(biāo)（體重除外）不顯著低于卵巢切除+溶劑組，可判定受試物具有有助于改善骨密度作用。附錄：鈣吸收實(shí)驗(yàn)在穩(wěn)定狀態(tài)下測(cè)定大鼠攝入的鈣量及糞便中排出的鈣量，兩者的差值即為表觀吸收的鈣。鈣的表觀吸收率（%）=（攝入鈣-糞鈣）/攝入鈣×100%由于鈣的吸收率受鼠齡、性別、飼料成分及鈣攝入水平的影響較大，應(yīng)在其他影響因素盡可能相同條件下，將受試樣品與碳酸鈣的吸收率進(jìn)行比較，對(duì)受試樣品鈣的吸收率進(jìn)行評(píng)價(jià)。2儀器及試劑2.1代謝鼠籠2.2動(dòng)物天平2.3原子吸收分光光度計(jì)：具火焰法測(cè)定裝置氘燈背景扣除2.4硝酸：優(yōu)級(jí)純2.5高氯酸：優(yōu)級(jí)純2.62%氧化鑭溶液：稱取分析純氧化鑭（含量>99.99%）25g，加75mL優(yōu)級(jí)純鹽酸，加去離子水至1000mL。2.7鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取1.2486g分析純碳酸鈣（純度大于99.99%加50mL去離子水，加鹽酸使之溶解。移入1000mL容量瓶中，加2%氧化鑭溶液至刻度。此溶液1.00mL相當(dāng)于500μg鈣。儲(chǔ)于聚乙烯瓶中，4℃保存，臨用時(shí)稀釋。3實(shí)驗(yàn)方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生4周左右的斷乳大鼠3.2基礎(chǔ)飼料：低鈣飼料配方見表14動(dòng)物分組及劑量設(shè)置實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組，以人體推薦量的5倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)一個(gè)低鈣對(duì)照組（150mg/100g飼料）和與相應(yīng)劑量受試物鈣水平相同的碳酸鈣對(duì)照組（如僅設(shè)一個(gè)碳酸鈣對(duì)照組，推薦設(shè)立與高劑量鈣水平相同的碳酸鈣對(duì)照組）。用低鈣對(duì)照組（150mg/100g飼料）飼料配制受試樣品各劑量組和碳酸鈣對(duì)照組。4.1生長(zhǎng)發(fā)育出生四周的斷乳大鼠經(jīng)適應(yīng)期1周后，分籠飼養(yǎng)4周。每組至少有同一性別動(dòng)物8只。飲用去離子水以避免從飲水中獲得鈣。每周測(cè)量身長(zhǎng)、體重一次。4.2代謝實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)3周后進(jìn)行3天鈣代謝實(shí)驗(yàn)。記錄3天進(jìn)食量，收集72小時(shí)糞便，測(cè)定飼料及糞便中鈣含量。4.3飼料及糞便中鈣的測(cè)定方法：用原子吸收分光光度法進(jìn)行測(cè)定4.3.1樣品采集與制備：飼料樣品經(jīng)均勻混合并過20目篩；鼠糞樣品在80℃烘箱中烘干，置干燥器中冷卻后磨細(xì)。注意防止在樣品制備過程中的污染。4.3.2樣品消化：根據(jù)樣品中鈣的含量，精確稱取烘干磨細(xì)的均勻樣品0.30－1.00g，置于