動(dòng)物源奇異變形桿菌新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因blaNDM PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

3.2縮略語(yǔ)動(dòng)物源奇異變形桿菌新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因blaNDMPCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了動(dòng)物源奇異變形桿菌新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因blaNDMPCR檢測(cè)技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、檢測(cè)原理、檢測(cè)條件、檢測(cè)方法和結(jié)果判定等。本文件適用于動(dòng)物源奇異變形桿菌新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因blaNDM的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)3.1術(shù)語(yǔ)和定義以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶（NDM）新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶（NDM）是一種金屬-β-內(nèi)酰胺酶（MBL能水解大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素（包括碳青霉烯類但不包括單環(huán)內(nèi)酰胺類（例如氨曲南）。碳青霉烯類抗生素是治療由大部分革蘭氏陰性菌引起的嚴(yán)重感染的主要抗菌藥物，臨床上可用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（包括阿維巴坦、克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦）不能抑制NDM水解活性。NDM-1在2008年首次從一名在印度新德里住院的瑞典患者身上分離出的肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)。目前已在腸桿菌科、不動(dòng)桿菌和假單胞菌等多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)了NDM-1，并已鑒定出31種NDM變體。3.1.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，其最大特點(diǎn)是能將微量DNA大幅增加。PCR技術(shù)能夠檢測(cè)和鑒別同菌種不同基因型的菌株，跟蹤耐藥基因的轉(zhuǎn)移和傳播，是分子流行病學(xué)調(diào)查研究的基礎(chǔ)方法。以下縮略語(yǔ)適用于本文件。SS：SS瓊脂（SalmonellaShigellaAgar）BHI：腦心浸出液肉湯（BrainHeartInfusionBroth）Tris-HCl：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）TBE：Tris-硼酸-EDTA緩沖液TE：Tris-EDTA緩沖液4原理通過(guò)對(duì)blaNDM基因的序列分析，利用PrimerPremier6.0軟件設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)特異性引物，建立了動(dòng)物源奇異變形桿菌新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因blaNDMPCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定引物的最佳退火溫度為55℃,該引物具有良好的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。用所建立的方法對(duì)40株山東地區(qū)雞源奇異變形桿菌中碳青霉烯類耐藥基因blaNDM進(jìn)行檢測(cè)分析。5試劑與耗材5.1美羅培南（MEM）5.2SS瓊脂（按照附錄A.1配制）5.3BHI肉湯（按照附錄A.2配制）5.41mol/LTris-HCl，pH8.0（按照附錄A.3配制）5.50.5mol/LEDTA，pH8.0（按照附錄A.4配制）5.6TE緩沖液（按照附錄A.5配制）5.710×TBE電泳緩沖液（按照附錄A.6配制）5.8瓊脂糖凝膠（按照附錄A.7配制）5.92×TaqMasterMix(DyePlμs)5.10DL2000PlμsDNAMarker5.13GoldView核酸染料5.14NDM特異性引物5.15八連管5.16離心管（0.2mL、1.5mL）6儀器與設(shè)備6.1立式高壓蒸汽滅菌器6.2生化恒溫培養(yǎng)箱6.3立式空氣恒溫振蕩培養(yǎng)箱6.4PCR儀6.5瓊脂糖凝膠電泳儀6.6凝膠成像系統(tǒng)6.7微波爐6.8微量移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）6.9冷凍離心機(jī)：離心力≥12.000g6.10水浴鍋6.11電子天平：精度0.1g、0.01g、0.001g7檢測(cè)方法7.1樣品準(zhǔn)備將奇異變形桿菌直接劃線于SS瓊脂平板（含有1μg/mL亞胺培南37℃孵育16-18h，選擇挑取單個(gè)黑色中心菌落接種至含1mLBHI肉湯的1.5mL離心管中。7.2樣品DNA提取將含1mLBHI肉湯的1.5mL離心管12,000rpm4℃冷凍離心10min，棄上清，加入200μLTE緩沖液重懸沉淀，放入100℃沸水中煮至少10min，取出后立即冰浴10min，1rpm4℃離心5min，取上清液即為樣品DNA。7.3PCR檢測(cè)以提取的樣品DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（含NDM耐藥基因奇異變形桿菌提取的DNA）、陰性對(duì)照（不含NDM耐藥基因奇異變形桿菌提取的DNA）及空白對(duì)照（不含模板DNA）。具體PCR檢測(cè)方法見附錄B。8結(jié)果判定8.1陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后出現(xiàn)984bp大小的條帶，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照不出現(xiàn)任何條帶，試驗(yàn)結(jié)果成立，反之不成立。8.2在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，樣品DNA擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照一致的984bp條帶，則說(shuō)明菌株中存在NDM耐藥基因，否則說(shuō)明不存在NDM耐藥基因。9注意事項(xiàng)采樣及檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)注意個(gè)人防護(hù)，戴口罩和手套、穿工作服：在無(wú)污染環(huán)境中操作，及時(shí)清理物品，用75%酒精對(duì)操作區(qū)域消毒處理，廢棄物經(jīng)高壓滅菌后按有關(guān)規(guī)定處理。附錄A（規(guī)范性）相關(guān)試劑的配制A.1SS瓊脂培養(yǎng)基準(zhǔn)確稱取牛肉粉5.0g，示月腺5.0g，乳糖10.0g，3號(hào)膽鹽8.5g，枸櫞酸鈉8.5g，硫代硫酸鈉8.5g，枸櫞酸鐵1.0g，中性紅0.025g,煌綠0.00033g，瓊脂17.0g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，室溫調(diào)pH值至6.9-7.1，加熱至煮沸，不必高壓蒸汽滅菌，冷至45-50℃倒成平板。A.2腦心浸出液肉湯（BHI）培養(yǎng)基準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.5g，氯化鈉5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氫二鈉(12H2O)2.5g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，室溫調(diào)pH至7.4±0.2，121℃高壓滅菌15min，備用。A.31mol/LTris-HCl，pH8.0157.6gTris-HCl溶于800mL超純水中，室溫調(diào)pH至8.0，加水至終體積1000mL，高壓滅菌。A.40.5mol/LEDTA，pH8.037.22gNa2EDTA.2H2O溶于160mL超純水中，加10mL10mol/LNaOH調(diào)pH至8.0，加水至終體積200mL，分成數(shù)份，高壓滅菌。A.5TE緩沖液（10mMTris-HCl：1mMEDTA）10mL1mol/LTris-HCL，pH8.0，2mL0.5mol/LEDTA，pH8.0，滅菌超純水稀釋至1000mL。A.610×TBE電泳緩沖液，pH8.3108gTris-base（0.9mol/L55g硼酸（0.9mol/L加入40mL0.5mol/LpH8.0EDTA儲(chǔ)存液（0.02mol/L溶于1000mL滅菌的超純水中，高壓滅菌。A.7瓊脂糖凝膠（15g/L）稱取1.5g瓊脂糖，加入10×TBE電泳緩沖液100mL，微波爐中加熱至瓊脂糖完成溶解。附錄B(規(guī)范性附錄)奇異變形桿菌NDM耐藥基因PCR檢測(cè)方法B.1奇異變形桿菌NDM耐藥基因特異性引物NDM-F:5’-ССААТАТТАТGСАСТСТGТСGС-3’NDM-R:5’-ТСАGТGТАGСТТGТСТGССАТGТ-3’B.2PCR擴(kuò)增按下列組分制備PCR反應(yīng)體系30μL，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，具體反應(yīng)體系見表B.1。將下列B.1PCR反應(yīng)體系中各組分加入八連管中，PCR反應(yīng)條件為：94℃4℃保存。表B.1PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組成體積(μL)模板DNA1引物NDM-F1引物NDM-R12×TaqMasterMix(DyePlμs)d