國(guó)科金韓驊教授

國(guó)家自然科學(xué)基金課題設(shè)計(jì)和申請(qǐng)書撰寫第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部遺傳與發(fā)育教研室韓驊面上項(xiàng)目是國(guó)家自然科學(xué)基金研究項(xiàng)目體系中的主要部分，其定位是全面均衡布局，瞄準(zhǔn)科學(xué)前沿，促進(jìn)學(xué)科發(fā)展，激勵(lì)原始創(chuàng)新；支持從事基礎(chǔ)研究的科學(xué)技術(shù)人員在國(guó)家自然科學(xué)基金資助范圍內(nèi)自由選題，開展創(chuàng)新性的科學(xué)研究，力圖通過研究得到新的發(fā)現(xiàn)或取得重要進(jìn)展。鼓勵(lì)開展具有前瞻性、勇于創(chuàng)新的探索性研究工作；注重保護(hù)非共識(shí)項(xiàng)目，支持探索性較強(qiáng)、風(fēng)險(xiǎn)性較大的創(chuàng)新研究。創(chuàng)新貫穿于整個(gè)科學(xué)研究活動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的創(chuàng)新基礎(chǔ)理論研究以問題為導(dǎo)向：實(shí)現(xiàn)理論創(chuàng)新臨床技術(shù)研究以需求為導(dǎo)向：實(shí)現(xiàn)技術(shù)創(chuàng)新、集成創(chuàng)新基礎(chǔ)理論研究一項(xiàng)腫瘤信號(hào)途徑（分子）的研究人類健康：人類生存、經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定腫瘤：對(duì)生命的威脅腫瘤細(xì)胞/腫瘤微環(huán)境細(xì)胞細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、凋亡、分化、遷移、侵襲信號(hào)途徑：某個(gè)信號(hào)途徑的意義和Crosstalk個(gè)別分子：某個(gè)分子的意義和分子間相互作用例如：降低Survivin對(duì)腫瘤進(jìn)行基因治療原理

Survivin降低能否抑制腫瘤？為什么（腫瘤細(xì)胞過表達(dá)Survivin嗎）？機(jī)制是什么？方案可行性

輸送系統(tǒng)？表達(dá)方法？靶向措施？實(shí)驗(yàn)研究模型？療效觀察指標(biāo)？實(shí)施后果體外模型中的效果？實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的效果？臨床觀察中的效果？臨床技術(shù)研究工程問題轉(zhuǎn)化為理論問題：研究發(fā)明的原理、方案可行性、實(shí)施后果……申請(qǐng)書內(nèi)容的構(gòu)思找到一個(gè)問題：立論依據(jù)

工作中遇到的問題?

社會(huì)公眾關(guān)心的熱點(diǎn)?

讀書思考的結(jié)果?規(guī)劃出一個(gè)解決問題的邏輯方案：研究?jī)?nèi)容

現(xiàn)象的確認(rèn)：形態(tài)變化、基因表達(dá)的觀察，臨床病例對(duì)照研究 機(jī)制的解析：細(xì)胞、信號(hào)途徑、分子 假說(shuō)的驗(yàn)證：轉(zhuǎn)染、KO、臨床應(yīng)用建立了可靠的研究信譽(yù)和資質(zhì)：研究基礎(chǔ)和條件 個(gè)人背景：前期研究業(yè)績(jī) 研究團(tuán)隊(duì)擬定題目（反映核心科學(xué)問題）制定寫作提綱確定研究目標(biāo)內(nèi)容（如何解決核心科學(xué)問題？）設(shè)計(jì)立論依據(jù)（為什么是核心科學(xué)問題？）建立基礎(chǔ)和團(tuán)隊(duì)（憑什么解決核心科學(xué)問題？）怎么撰寫？面上項(xiàng)目報(bào)告正文撰寫提綱（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容：1、項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)2、項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題3、擬采取的研究方案及可行性分析4、本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。5、年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1、工作基礎(chǔ)2、工作條件3、申請(qǐng)人簡(jiǎn)介4、承擔(dān)科研項(xiàng)目情況5、完成自然科學(xué)基金項(xiàng)目情況（三）經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)說(shuō)明（四）其他附件清單要求內(nèi)容翔實(shí)、清晰，層次分明，標(biāo)題突出摘要整個(gè)申請(qǐng)書的提綱：400字，4層意思，句句切題，不能出錯(cuò)！

科學(xué)問題：xxx是xxx，但是存在xxx問題?；舅悸罚何墨I(xiàn)和我們以往的研究工作表明，xx可能是xx.

基本研究?jī)?nèi)容：本課題擬xxx,xxx,xxx。主要研究意義：這些研究具有xx理論意義和xxx實(shí)際意義。Notch信號(hào)途徑通過miRNA調(diào)控神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖和分化在哺乳類神經(jīng)發(fā)育中，神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）以特定的時(shí)空順序進(jìn)行增殖、分化和遷移，最終形成具有高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的神經(jīng)系統(tǒng)。大量文獻(xiàn)和我們最近發(fā)表的研究證明，經(jīng)典Notch途徑對(duì)NSC的增殖和分化發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，但其下游分子和調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。我們最近在Notch途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J條件性基因剔除小鼠用神經(jīng)球培養(yǎng)對(duì)比了正常和Notch信號(hào)阻斷的NSC的miRNA表達(dá)譜，鑒定出一組在正常和Notch缺陷NSC中差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)其中個(gè)別分子在Notch信號(hào)調(diào)控NSC中的作用進(jìn)行了初步探討。本課題擬在此基礎(chǔ)上，深入研究Notch信號(hào)調(diào)控這組候選miRNA的分子機(jī)制；揭示候選miRNA在NSC增殖分化中的作用和機(jī)制；闡明候選miRNA在Notch信號(hào)途徑中的功能意義。這些研究可以拓展對(duì)Notch信號(hào)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還可以發(fā)現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育中NSC增殖分化調(diào)控的新機(jī)制，具有重要的理論意義。

（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容（4000-8000字）立項(xiàng)依據(jù)1、研究意義2、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析3、主要參考文獻(xiàn)目錄常見問題：1、寫成了國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀2、提煉不出來(lái)自己的研究有什么意義3、完全沒有闡述本課題的基本研究?jī)?nèi)容，所以無(wú)從闡述本研究的意義1、研究意義：結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢(shì)來(lái)論述科學(xué)意義結(jié)合國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題來(lái)論述應(yīng)用前景放大、修改版的摘要：（1）從更廣泛的層面上對(duì)研究意義進(jìn)行闡述，如某種疾病對(duì)公眾健康的影響，某一個(gè)現(xiàn)象或問題對(duì)學(xué)科發(fā)展的意義，等等（2）通過分析現(xiàn)在存在的問題、自己的前期結(jié)果，引伸到自己的研究?jī)?nèi)容（3）針對(duì)這些問題，本課題開展的研究?jī)?nèi)容（4）本課題的研究有什么科學(xué)意義、應(yīng)用前景脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的高度有組織的結(jié)構(gòu)是其正常行使功能的基礎(chǔ)，而正常有序的發(fā)育則是其復(fù)雜結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)。哺乳類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）是從定位于神經(jīng)管管壁靠近管腔側(cè)（發(fā)育中的室管膜帶）的神經(jīng)干細(xì)胞（NSC，neuralstemcells）增殖、分化而來(lái)。NSC可以通過對(duì)稱分裂來(lái)增殖，還可通過不對(duì)稱分裂在自我更新的同時(shí)產(chǎn)生中間神經(jīng)祖細(xì)胞（INP，intermediateneuralprogenitors）。神經(jīng)祖細(xì)胞則在細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)的共同作用下在不斷通過對(duì)稱分裂而增殖的同時(shí)沿著特定的路線進(jìn)行遷移，并不斷分化產(chǎn)生各種類型的子代神經(jīng)細(xì)胞，再組裝成不同的神經(jīng)結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其功能。正確理解NSC維持自身增殖、NSC向下游細(xì)胞的分化、以及進(jìn)一步遷移、分化成成熟神經(jīng)細(xì)胞和形成神經(jīng)連接的分子機(jī)制，不僅對(duì)于了解神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)形成十分重要，也對(duì)認(rèn)識(shí)包括人類的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)的功能以及相關(guān)人類疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。

Notch信號(hào)途徑是神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號(hào)途徑之一。最近，我們用小鼠Nestin基因增強(qiáng)子建立了在NSC中特異表達(dá)重組酶Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠（ZhangQetal.NeurosciLett.2005;379:90-95），并與本研究室以往建立的RBP-J-Floxed小鼠交配得到了在NSC特異剔除RBP-J的條件性基因剔除小鼠。表型分析發(fā)現(xiàn)從RBP-J條件性基因剔除小鼠胚胎分離培養(yǎng)的神經(jīng)球（Neurosphere）具有明顯降低的自我更新能力和增強(qiáng)的分化潛能，并且向神經(jīng)元的方向分化增加（GaoFetal.MolCellNeurosci.2009;40:442-450）；體外神經(jīng)元培養(yǎng)還發(fā)現(xiàn)RBP-J缺陷神經(jīng)元的神經(jīng)突起生長(zhǎng)減少（GaoFetal.Unpublished）。然而，這些工作和國(guó)際上本領(lǐng)域的相關(guān)研究都還未能闡明Notch信號(hào)途徑是通過哪些下游分子、如何調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的。

近幾年發(fā)現(xiàn)的microRNA（miRNA）在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富并具有一定時(shí)空特性。多項(xiàng)研究已經(jīng)提示miRNA參與了NSC的分化。Notch信號(hào)途徑作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)途徑之一，是否可通過調(diào)控某些miRNA影響NSC及其下游細(xì)胞的增殖分化？針對(duì)這一問題，本課題組利用神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)法從RBP-J剔除小鼠和對(duì)照小鼠分別培養(yǎng)了NSC，利用miRNA表達(dá)芯片對(duì)比分析，結(jié)合生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)回顧，獲得了一組（7個(gè)）在RBP-J剔除神經(jīng)球和對(duì)照神經(jīng)球之間有明顯差異表達(dá)并可能具有潛在功能的miRNA（見工作基礎(chǔ)）。本項(xiàng)目擬在此基礎(chǔ)上檢測(cè)這些候選miRNA在小鼠CNS發(fā)育過程中的表達(dá)，在培養(yǎng)的細(xì)胞中和小鼠體內(nèi)分析候選miRNA對(duì)NSC自我更新、增殖和分化的調(diào)控作用，繼而進(jìn)一步深入研究其調(diào)控機(jī)制，尤其與Notch信號(hào)的關(guān)系。這些研究：①可以明確參與調(diào)控NSC自我更新和分化的新的miRNA，并初步闡明其作用的機(jī)制；②就我們掌握的文獻(xiàn)，到目前為止還沒有報(bào)道在哺乳類Notch信號(hào)可以通過miRNA調(diào)控發(fā)育過程，所以本課題有望揭示Notch信號(hào)調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的新機(jī)制，具有重要意義。2、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析：領(lǐng)域的基本知識(shí)介紹(Biology)所研究的問題的研究現(xiàn)狀，包含自己發(fā)表的論文(Molecule)以本課題的研究邏輯和研究意義結(jié)尾(Biology)

圍繞課題的思路進(jìn)行綜述，層次清晰，步步提示存在問題，觀點(diǎn)鮮明，把自己的研究思路暗含在對(duì)文獻(xiàn)的綜述中，最后用自己的研究提出解決辦法常見問題：1、綜述不全面、沒有很好地閱讀、忽略了重要進(jìn)展（尤其是國(guó)內(nèi)專家）2、邏輯思路不清晰，沒有圍繞一個(gè)中心問題進(jìn)行綜述3、自說(shuō)自話，只是以自己的前期研究為依據(jù)4、過多引用未發(fā)表的Data5、以未見報(bào)道為依據(jù)（在其他的腫瘤已有結(jié)論，現(xiàn)在換個(gè)腫瘤）國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀NSC增殖分化調(diào)控的一般知識(shí)1、Notch信號(hào)途徑及其對(duì)NSC增殖分化的調(diào)控作用：1.1Notch信號(hào)途徑1.2Notch信號(hào)對(duì)神經(jīng)分化的調(diào)控2、miRNA對(duì)NSC/INP增殖分化的調(diào)控作用：2.1miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)

2.2miRNA對(duì)NSC分化命運(yùn)的選擇具有十分重要的作用3、Notch途徑和miRNA的關(guān)系4、Summary3、主要參考文獻(xiàn)：(顯示科學(xué)態(tài)度!) 準(zhǔn)確 及時(shí)更新 格式規(guī)范一致 與正文對(duì)應(yīng)

國(guó)內(nèi)科學(xué)家、中文論文引用Yao-ChunWang,FeiHe,Xiao-WeiLiu,Guang-YingDong,Hong-YanQin,Xing-BinHu,FanFeng,Min-HuaZheng,LiangLiang,LeiFeng,Ying-MinLiang,HuaHan.NotchsignalingdeterminestheM1versusM2polarizationofmacrophagesinanti-tumorimmuneresponses.CancerRes.2010;70:4840-4849.(封面標(biāo)題)研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題（此部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容）

研究目標(biāo)：本課題的總體研究目的和達(dá)到的程度，要一目了然。一句話講出：通過xxx，闡明xxx，為xxx奠定基礎(chǔ)。常見問題： 研究目標(biāo)太大/太小 研究目標(biāo)與研究?jī)?nèi)容混淆研究?jī)?nèi)容：圍繞著上述研究目標(biāo)，（1）打算開展幾個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)研究？（2）每個(gè)方面都進(jìn)行哪些實(shí)驗(yàn)？例如對(duì)一個(gè)新基因的功能研究：1、表達(dá)：在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行表達(dá)范圍分析（Northern,RT-PCR,原位雜交）、細(xì)胞內(nèi)定位分析（免疫熒光染色、融合蛋白表達(dá)）2、功能：在體外對(duì)細(xì)胞功能的影響：轉(zhuǎn)染、干擾；增殖、凋亡、分化、遷移、形態(tài)變化？體內(nèi)功能研究：KO？轉(zhuǎn)基因小鼠？病例相關(guān)的分析？3、作用機(jī)制：轉(zhuǎn)錄調(diào)控？信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)？上、下游分子？相互作用蛋白？4、表達(dá)調(diào)控：?jiǎn)?dòng)子結(jié)構(gòu)？表觀遺傳修飾？翻譯后調(diào)控？常見問題： 層次條理不清楚：針對(duì)一個(gè)問題需要做哪幾個(gè)方面的研究？邏輯關(guān)系 內(nèi)容簡(jiǎn)繁不得當(dāng)：（生物信息學(xué)、構(gòu)建質(zhì)粒；篩選、構(gòu)建小鼠、轉(zhuǎn)錄調(diào)控） 和研究方案混淆：羅列具體的實(shí)驗(yàn)步驟在前期工作已經(jīng)獲得RBP-J基因剔除NSC與正常NSC差異miRNA的基礎(chǔ)上，檢測(cè)這些候選miRNA在小鼠CNS發(fā)育過程中的表達(dá)特點(diǎn)，在培養(yǎng)的細(xì)胞中和小鼠體內(nèi)分析重要候選miRNA對(duì)NSC自我更新、增殖和分化的調(diào)控作用，繼而進(jìn)一步深入研究其調(diào)控機(jī)制，尤其與Notch信號(hào)的關(guān)系，以期明確miRNA參與介導(dǎo)Notch信號(hào)調(diào)控NSC自我更新增殖和分化的信號(hào)通路、作用機(jī)制和意義，為揭示哺乳類中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究目標(biāo)：1、候選miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的表達(dá)。利用miRNA提取和反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)明確候選miRNA在不同胎齡小鼠的相關(guān)腦區(qū)的時(shí)空表達(dá)特征；利用LNA修飾的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交（Kloosterman,W.P.etal.2006,Nat.Methods.3,27-29），在體檢測(cè)候選miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的時(shí)空表達(dá)情況。2、候選miRNA對(duì)NSC增殖分化的調(diào)控作用。利用生物合成的miRNAmimics和inhibits分別轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞系細(xì)胞和培養(yǎng)的原代神經(jīng)球（Sathyan,P.etal.2007,J.Neurosci.27,8546-8557），初步觀察候選miRNA對(duì)NSC增殖分化等生物學(xué)行為的影響；利用病毒感染體系構(gòu)建含有EGFP的針對(duì)候選miRNA的過表達(dá)載體，以及反義序列的表達(dá)載體，感染原代培養(yǎng)的神經(jīng)球，觀察NSC增殖分化等細(xì)胞生物學(xué)行為的變化；用胚胎電轉(zhuǎn)染的方法將上述過表達(dá)載體和反義載體轉(zhuǎn)染至不同階段小鼠胚胎的室管膜（下）帶，結(jié)合NSC增殖分化相關(guān)的標(biāo)記物的免疫熒光染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察被轉(zhuǎn)染的NSC的變化。研究?jī)?nèi)容：3、候選miRNA調(diào)控NSC增殖分化的分子機(jī)制。首先探討差異表達(dá)的miRNA與Notch信號(hào)的關(guān)系，主要研究這些差異miRNA是否是Notch信號(hào)途徑的下游分子，包括其啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析（RBP-J或Hes家族識(shí)別序列的存在與否），以及用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)這些miRNA的表達(dá)是否受Notch/RBP-J信號(hào)的調(diào)控。其次是借助生物信息學(xué)方法分析miRNA靶分子，并綜合使用Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、基因轉(zhuǎn)染和定量RT-PCR、定位突變等方法分析miRNA對(duì)靶分子的調(diào)控作用，再根據(jù)靶分子的特征進(jìn)行更加深入的分子機(jī)制的研究。4、體內(nèi)驗(yàn)證Notch途徑和候選miRNA之間的調(diào)控關(guān)系。對(duì)于經(jīng)過分子水平驗(yàn)證的miRNA，用過表達(dá)或是抑制表達(dá)的病毒載體來(lái)感染RBP-J剔除胚胎小鼠，觀察我們前期觀察到的NSC增殖分化異常(GaoF,etal.MolCellNeurosci.2009,40:442-450)是否能夠被挽救，以驗(yàn)證Notch途徑和候選miRNA兩者在體內(nèi)的調(diào)節(jié)關(guān)系。

研究?jī)?nèi)容：擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題：（1）什么是自己研究的領(lǐng)域的關(guān)鍵科學(xué)問題？為什么？（2）本研究解決這個(gè)問題的邏輯思路是什么？解決這個(gè)問題有何意義？本課題擬回答的關(guān)鍵科學(xué)問題：本課題擬回答的根本科學(xué)問題是Notch信號(hào)調(diào)控NSC增殖分化的分子機(jī)制問題。文獻(xiàn)報(bào)道和我們的前期工作得出了Notch信號(hào)調(diào)控NSC的一致結(jié)論，但進(jìn)一步的分子機(jī)制是有待回答的進(jìn)一步問題。而Notch通路和miRNA分子在NSC發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的作用，但是他們之間是否存在cross-talk？如果有，各自在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中又分別扮演著什么角色？?jī)烧咧g是如何相互影響相互調(diào)控的？這種相互調(diào)控最終對(duì)NSC的增殖分化又會(huì)是怎樣的影響？這些調(diào)控和調(diào)控間的相互作用可能貫穿著神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的全過程。闡明這些調(diào)控因素之間的相互作用，不僅對(duì)于我們理解NSC發(fā)育的基本過程有著重要的意義，而且對(duì)于我們將來(lái)利用NSC進(jìn)行疾病治療也具有至關(guān)重要的意義。本課題前期通過miRNA芯片在Notch途徑阻斷的小鼠中檢測(cè)到一組發(fā)生改變的miRNA分子，我們擬在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)觀察Notch途徑對(duì)miRNA的調(diào)控，以明確這兩個(gè)在NSC發(fā)育過程中都十分重要的因素之間的相互作用，以及他們的相互作用對(duì)于NSC增殖分化的調(diào)控。課題設(shè)計(jì)的原則對(duì)照原則：醫(yī)學(xué)研究主要是通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差別來(lái)回答干預(yù)因素的效應(yīng)，所以完美的對(duì)照組設(shè)計(jì)十分重要重復(fù)原則：醫(yī)學(xué)研究是設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，差別的真實(shí)性需要經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，所以保質(zhì)保量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)是發(fā)現(xiàn)真理的保證擬采取的研究方案及可行性分析（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說(shuō)明）

研究方法：用xxx觀察分析xxx；用xxx觀察分析xxx；……技術(shù)路線：最好圖示一個(gè)總體技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)研究方案：結(jié)合技術(shù)路線，把研究?jī)?nèi)容里的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)具體化（步驟、分組、……對(duì)照、重復(fù)）關(guān)鍵技術(shù)說(shuō)明：課題可能遇到的技術(shù)難點(diǎn)，需加以說(shuō)明常見問題：（1）技術(shù)路線圖太復(fù)雜（2）研究方案與研究?jī)?nèi)容不吻合，只是簡(jiǎn)單地羅列方法和Protocol（3）研究方案過于繁瑣或過于簡(jiǎn)單，尤其是過分簡(jiǎn)單（4）方案不完善甚至出錯(cuò)：該做的實(shí)驗(yàn)沒有寫；用人組織樣品雜交小鼠芯片；購(gòu)買某公司的試劑，而該公司已倒閉；寫的是別的課題的方案；……（5）關(guān)鍵技術(shù)需要說(shuō)明：基因剔除小鼠；關(guān)鍵抗體；……可行性分析：（1）理論可行性（2）條件可行性（3）研究基礎(chǔ)可行性、……1）miRNA靶基因的篩選將可能是本課題面臨的重要的技術(shù)問題。miRNA的靶分子預(yù)測(cè)顯示動(dòng)物全部基因中有多于1/3的基因都可能受到miRNA的調(diào)控（LewisBPetal.2005,Cell.120,15–20）。而且一個(gè)miRNA可能抑制多個(gè)靶分子mRNA的翻譯，一個(gè)mRNA又會(huì)受到多個(gè)miRNA的調(diào)節(jié)（BartelDP.2004,Cell.116,281–297）。這為候選miRNA靶基因的篩選帶來(lái)很大的困難。因此，充分利用生物信息學(xué)分析方法，并結(jié)合已知的調(diào)節(jié)NSC增殖分化的分子信息知識(shí)，在本課題中顯得十分重要。2）對(duì)候選miRNA進(jìn)行體內(nèi)的功能研究也將有一定難度。主要是如何提高特定miRNA在原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞和在體轉(zhuǎn)染的效率。這一點(diǎn)我們擬通過構(gòu)建病毒載體，來(lái)進(jìn)行原代培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染；而在體的轉(zhuǎn)染，我們擬通過構(gòu)建病毒載體結(jié)合胚胎電轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行。課題組成員鄭敏化博士在中國(guó)科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所工作期間已經(jīng)針對(duì)本技術(shù)接受了專門訓(xùn)練，并已將此方法成功應(yīng)用于關(guān)于視網(wǎng)膜發(fā)育的研究（Zhengetal.2009,MolBrain2:38）。關(guān)鍵技術(shù)說(shuō)明：容易讓人懷疑的研究?jī)?nèi)容和方案，需要特別說(shuō)明項(xiàng)目特色與創(chuàng)新之處項(xiàng)目特色：研究過程中的研究思路、目標(biāo)、內(nèi)容、方案、關(guān)鍵問題、可行性與現(xiàn)有研究相比有哪些不一樣（特色） 具有不一樣的研究意義？ 抓住了不一樣的研究問題？ 從不一樣的角度研究問題？ 采用了不一樣的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和方法？

……創(chuàng)新之處：研究結(jié)束后會(huì)產(chǎn)生哪些新知識(shí)（創(chuàng)新）

新理論、新機(jī)制、新解釋、新功能

新分子、新通路、新靶點(diǎn)、新型相互作用

新方法、新技術(shù)、新療法、新研究平臺(tái)

……特色與創(chuàng)新本課題在以往工作的基礎(chǔ)上提出“Notch信號(hào)通過miRNA調(diào)控哺乳類NSC增殖分化”，并在前期工作中篩選到一組在Notch信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J基因剔除后差異表達(dá)的miRNA。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明其在NSC中的作用及其與Notch信號(hào)的關(guān)系。這些研究：①可以明確參與調(diào)控NSC自我更新和分化的新的miRNA，并初步闡明其作用的新機(jī)制；②就我們掌握的文獻(xiàn)，雖然已知多種miRNA可以調(diào)控Notch信號(hào)某些分子的表達(dá)，但到目前為止還沒有報(bào)道在哺乳類Notch信號(hào)可以通過miRNA調(diào)控發(fā)育過程，所以本課題的研究有望揭示Notch信號(hào)調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的新機(jī)制，具有明顯的理論創(chuàng)新性。本課題組研究Notch信號(hào)途徑功能的突出特色在于課題組建立的RBP-J條件性基因剔除小鼠平臺(tái)。由于RBP-J是Notch四種受體的共同下游分子，較之以往Notch1剔除等模型，RBP-J條件性剔除的最大優(yōu)勢(shì)在于實(shí)現(xiàn)經(jīng)典Notch信號(hào)的條件性完全阻斷，全面反映經(jīng)典Notch信號(hào)途徑的調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上獲得候選miRNA，在本研究中經(jīng)過細(xì)胞和分子水平的研究后再在RBP-J條件性剔除小鼠上證實(shí)其作用，可以最大限度地獲得Notch-miRNA相互關(guān)系的體內(nèi)證據(jù)，有明顯特色。

年度研究計(jì)劃和預(yù)期結(jié)果（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動(dòng)、國(guó)際合作與交流計(jì)劃等）

年度計(jì)劃：合理劃分：四年

研究?jī)?nèi)容：分散在四年，不能只寫題目國(guó)際合作與交流計(jì)劃預(yù)期結(jié)果：

1、理論成果：闡明xxx，解決xxx問題

2、發(fā)表論文

3、可能產(chǎn)生的專利

4、人才培養(yǎng)工作基礎(chǔ)（與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績(jī)）

相關(guān)研究工作積累：項(xiàng)目相關(guān)已經(jīng)發(fā)表的工作的核心內(nèi)容

沒有發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：要有Legend!已取得的研究工作成績(jī)：

1、理論成果：獲獎(jiǎng)

2、發(fā)表論文

3、已經(jīng)產(chǎn)生的專利

4、人才培養(yǎng)按照研究?jī)?nèi)容的“故事”邏輯歸納總結(jié)，突出重點(diǎn)避免羅列工作條件（包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑，包括利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況。）1、已經(jīng)具備的實(shí)驗(yàn)條件：全校都可寫，注意與研究方法吻合2、尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件：動(dòng)物、儀器設(shè)備 解決途徑：動(dòng)物購(gòu)買合同、儀器設(shè)備使用協(xié)議、合作協(xié)議3、國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室 腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部XX重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 軍隊(duì)XX重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷包括申請(qǐng)人和項(xiàng)目組主要參與者的學(xué)歷和研究工作簡(jiǎn)歷，近期已發(fā)表與本項(xiàng)目有關(guān)的主要論著目錄和獲得學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)情況及在本項(xiàng)目中承擔(dān)的任務(wù)。論著目錄要求詳細(xì)列出所有作者、論著題目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止頁(yè)碼等；獎(jiǎng)勵(lì)情況也須詳細(xì)列出全部受獎(jiǎng)人員、獎(jiǎng)勵(lì)名稱等級(jí)、授獎(jiǎng)年等申請(qǐng)人和主要參與者：（1）學(xué)歷和研究工作簡(jiǎn)歷：主要學(xué)歷和簡(jiǎn)歷，強(qiáng)調(diào)與本課題相關(guān)的（2）論著：Yao-ChunWang,FeiHe,Xiao-WeiLiu,Guang-YingDong,Hong-YanQin,Xing-BinHu,FanFeng,Min-HuaZheng,LiangLiang,LeiFeng,Ying-MinLiang,HuaHan.NotchsignalingdeterminestheM1versusM2polarizationofmacrophagesinanti-tumorimmuneresponses.CancerRes.2010;70:4840-4849.(封面文章)

（3）獎(jiǎng)勵(lì)：韓驊，秦鴻雁，王冀姝，楊曦，梁英民，孫強(qiáng)，李軍林，李軍鋒：Notch信號(hào)途徑對(duì)細(xì)胞分化的調(diào)控及其機(jī)理的研究，陜西省科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)，2006年課題組：真實(shí)性、職稱均衡、合理分工、研究生參與……承擔(dān)科研項(xiàng)目情況（申請(qǐng)者和項(xiàng)目組主要成員正在承擔(dān)的科研項(xiàng)目情況，包括自然科學(xué)基金的項(xiàng)目，要注明項(xiàng)目的名稱和編號(hào)、經(jīng)費(fèi)來(lái)源、起止年月、負(fù)責(zé)的內(nèi)容等。）強(qiáng)調(diào)與本課題的關(guān)系和區(qū)別評(píng)委可以隨時(shí)查閱!完成國(guó)家自然科學(xué)基金情況重點(diǎn)項(xiàng)目立項(xiàng)的思考核心科學(xué)問題（題目與依據(jù)）重大學(xué)科前沿問題、國(guó)家發(fā)展重大問題（遵照指南）有足夠的普遍性和代表性解決問題的思路（目標(biāo)與內(nèi)容）全面：分子、細(xì)胞、動(dòng)物、人體具有內(nèi)在的邏輯關(guān)系凝練好特色和創(chuàng)新研究工作基礎(chǔ)（基礎(chǔ)和團(tuán)隊(duì)）前期的創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)：負(fù)責(zé)人的5篇代表作，至少1篇發(fā)表在學(xué)科主流以上的雜志必須與本課題相關(guān)：可以作為本課題的直接工作基礎(chǔ)/條件好的研究平臺(tái)同一方向完成3項(xiàng)左右的面上項(xiàng)目后可考慮新生血管形態(tài)形成及其分子調(diào)控機(jī)理的研究血管的形態(tài)發(fā)生是胚胎和成年個(gè)體新生血管網(wǎng)形成的核心步驟，形態(tài)完整的血管網(wǎng)不僅是胚胎發(fā)育的需要，還參與成年個(gè)體創(chuàng)傷修復(fù)及組織再生等生理過程，而形態(tài)異常的血管結(jié)構(gòu)與腫瘤、糖尿病眼底損害等疾病密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠條件性剔除Notch信號(hào)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J，可以引起動(dòng)物廣泛而嚴(yán)重的自發(fā)新生血管形成，但形成的新生血管不具有正常的血管形態(tài)和功能。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，這些結(jié)果提示Notch信號(hào)途徑是正常血管形態(tài)形成的必需信號(hào)。本課題擬在此基礎(chǔ)上，深入探討Notch信號(hào)途徑在血管形態(tài)形成中對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控作用；明確Notch信號(hào)途徑阻斷引起自發(fā)新生血管形態(tài)形成異常的細(xì)胞基礎(chǔ)；闡明Notch信號(hào)途徑調(diào)控新生血管形成的分子機(jī)理及其與其他信號(hào)途徑的相互作用。這些研究對(duì)于深入了解血管形態(tài)形成的分子調(diào)控機(jī)理，以及在此基礎(chǔ)上開發(fā)血管靶向藥物，具有重要的理論和實(shí)際意義。2008年招標(biāo)方向：形態(tài)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制立論依據(jù)血管發(fā)育及其調(diào)控血管發(fā)生血管形成動(dòng)脈形成Notch與血管發(fā)育Notch信號(hào)途徑Notch與血管發(fā)育Notch與血管形態(tài)形成的關(guān)系不明確，機(jī)制不清楚調(diào)控機(jī)制不完全清楚；都與Notch有關(guān)（下文）融入自己的工作研究目標(biāo)以Notch/RBP-J信號(hào)途徑為核心，闡明血管形態(tài)形成過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，為血管靶向藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容Notch信號(hào)途徑在血管形態(tài)形成中對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用：利用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性可誘導(dǎo)Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（Tie2-ERTCre，見工作基礎(chǔ)），與RBP-Jfloxed小鼠交配后，誘導(dǎo)在血管內(nèi)皮細(xì)胞條件性剔除RBP-J基因。觀察體內(nèi)自發(fā)新生血管形成和創(chuàng)傷、腫瘤等誘導(dǎo)的新生血管形成。通過體內(nèi)的組織學(xué)分析和免疫組織化學(xué)染色分析，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞在Notch/RBP-J信號(hào)阻斷后的增殖、凋亡、偽足生長(zhǎng)、以及動(dòng)-靜脈標(biāo)志表達(dá)等的變化，以全面了解RBP-J基因剔除引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能變化。通過體外血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，分析RBP-J剔除后小鼠內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的改變以及細(xì)胞周期時(shí)相和調(diào)控分子的改變；觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞偽足生長(zhǎng)和遷移黏附的改變；通過體外三維培養(yǎng)分析RBP-J基因剔除后小鼠內(nèi)皮細(xì)胞形成血管網(wǎng)的能力的變化。研究?jī)?nèi)容Notch信號(hào)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的影響：利用Mx-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和RBP-Jfloxed小鼠在血管平滑肌中剔除RBP-J以阻斷Notch信號(hào)途徑。在上述新生血管形成模型中觀察新生血管形態(tài)形成中血管平滑肌細(xì)胞的募集和遷移黏附等細(xì)胞生物學(xué)變化，觀察其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。建立體外血管內(nèi)皮細(xì)胞-血管平滑肌細(xì)胞的共培養(yǎng)，然后分別以RBP-J剔除的內(nèi)皮細(xì)胞與野生型平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)、或RBP-J剔除的平滑肌細(xì)胞與野生型內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，判斷Notch信號(hào)途徑在內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞相互作用中的意義。Notch信號(hào)途徑對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響：利用Mx-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和RBP-Jfloxed小鼠在骨髓中剔除RBP-J以阻斷Notch信號(hào)途徑。用流式細(xì)胞儀分析骨髓和外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平的變化。在MxCre-RBPfloxed小鼠中進(jìn)一步引入GFP轉(zhuǎn)基因，然后將GFP+RBP-J剔除的骨髓細(xì)胞移植到正常受體小鼠，觀察GFP+內(nèi)皮祖細(xì)胞在受體小鼠中的分化以及參與新生血管形態(tài)形成的變化。研究?jī)?nèi)容Notch信號(hào)調(diào)節(jié)血管形態(tài)形成的下游分子：利用小鼠基因芯片，分析RBP-J剔除的內(nèi)皮細(xì)胞和正常對(duì)照內(nèi)皮細(xì)胞之間基因表達(dá)的差異，尋找RBP-J調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化的下游分子；利用Westernblot分析培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中MAPK信號(hào)途徑和PI-3-K/Akt信號(hào)途徑主要分子的水平和磷酸化水平的改變；利用相應(yīng)信號(hào)途徑的特異抑制劑分析其在Notch信號(hào)阻斷引起的內(nèi)皮細(xì)胞變化中的意義。Notch信號(hào)途徑調(diào)節(jié)血管形態(tài)形成中與其他信號(hào)途徑的相互作用：利用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)、染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)等分子生物學(xué)方法，重點(diǎn)研究Notch信號(hào)途徑與VEGFR信號(hào)途徑、EphrinB2/EphB4信號(hào)的相互調(diào)控關(guān)系及其在新生血管形態(tài)形成中的意義。擬解決的關(guān)鍵問題擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題：本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是血管形態(tài)形成的分子調(diào)控機(jī)理。與其他器官的形態(tài)形成一樣，血管的形態(tài)形成受到多個(gè)信號(hào)途徑的多階段調(diào)控。大量的文獻(xiàn)和我們的研究結(jié)果都提示Notch信號(hào)途徑在血管形態(tài)形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮核心作用，但其作用的細(xì)胞和分子機(jī)理并不清楚。本課題擬在以往工作的基礎(chǔ)上，利用已經(jīng)建立的條件性基因剔除小鼠模型，結(jié)合其他細(xì)胞和分子生物學(xué)手段進(jìn)行深入研究，可望以Notch信號(hào)途徑為核心，闡明血管形態(tài)形成的分子調(diào)控機(jī)理。擬解決的關(guān)鍵問題擬解決的關(guān)鍵技術(shù)問題：形態(tài)發(fā)育的研究離不開動(dòng)物模型。既往對(duì)Notch在哺乳類血管形態(tài)發(fā)育中的作用的研究主要使用Notch信號(hào)途徑的主要分子的常規(guī)基因剔除模型，觀察早期胚胎中血管的形態(tài)形成缺陷和細(xì)胞改變。此外，Dll4基因剔除的雜合子小鼠或部分非純系純合子小鼠可發(fā)育到出生，觀察這些小鼠的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)也能更好地反映血管網(wǎng)的生長(zhǎng)和EC的變化。但這些小鼠模型存在不同的缺陷。比如，Notch信號(hào)的主要分子的基因剔除往往引起早期胚胎死亡，限制了對(duì)其形態(tài)變化的深入研究尤其是在成體動(dòng)物研究中的應(yīng)用；其次，哺乳動(dòng)物有四種Notch受體，分布重疊而且有功能代償。單純剔除一種受體或配體難以反映整個(gè)信號(hào)途徑作用的全貌。申請(qǐng)人建立的轉(zhuǎn)錄因子RBP-J條件性基因剔除小鼠模型可以基本解決這些問題。我們的前期研究證實(shí)，利用這一系統(tǒng)可以在成年動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞剔除RBP-J，同時(shí)由于RBP-J介導(dǎo)全部四種Notch受體的轉(zhuǎn)錄激活作用，所以這一系統(tǒng)可以在成年動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞中完全阻斷Notch信號(hào)，從而反映出Notch信號(hào)在小鼠血管形態(tài)生成中的作用。利用Cre-LoxP系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因剔除，關(guān)鍵是Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的建立。我們?cè)谇捌谘芯恐胁捎昧薓xCre。雖然可以在內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行有效的剔除，但該系統(tǒng)同時(shí)可在其他組織如骨髓中表達(dá)Cre。為了提高在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Cre的專一性，我們進(jìn)一步構(gòu)建了Tie2-ERTCre，已經(jīng)得到Founder小鼠。該小鼠可以在Tamoxifen誘導(dǎo)后，可以特異地在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)Cre，實(shí)現(xiàn)組織特異性可誘導(dǎo)剔除。

項(xiàng)目的特色和創(chuàng)新之處項(xiàng)目特色：（1）由于RBP-J介導(dǎo)四種Notch受體的轉(zhuǎn)錄激活活性，本課題所得結(jié)果可以回答Notch在體內(nèi)對(duì)血管形態(tài)形成中的作用。本項(xiàng)目利用已經(jīng)建立的RBP-J條件性基因剔除小鼠研究Notch信號(hào)途徑在成體血管生成中的作用，具有可靠的工作基礎(chǔ)和前期研究結(jié)果。結(jié)合深入的分子生物學(xué)研究，可闡明血管形態(tài)形成的細(xì)胞和分子機(jī)理。（2）以往文獻(xiàn)中多采用胚胎期血管形成模型（包括新生小鼠的視網(wǎng)膜血管發(fā)生）進(jìn)行關(guān)于血管形態(tài)的發(fā)生的研究。本研究采用成年動(dòng)物新生血管形態(tài)形成為模型進(jìn)行研究，研究結(jié)果可能直接具有醫(yī)學(xué)意義。創(chuàng)新之處：（1）雖然有關(guān)血管形成中血管形態(tài)形成已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但到目前位置參與血管形態(tài)形成的信號(hào)途徑、作用機(jī)理和相互作用還沒有內(nèi)完全闡明。本課題組首先在成年個(gè)體血管內(nèi)皮細(xì)胞中剔除RBP-J，發(fā)現(xiàn)血管形成雖然明顯增加但血管形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能異常。本課題在以往工作的基礎(chǔ)上，以Notch-RBP-J信號(hào)途徑為核心研究血管形態(tài)形成中的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合進(jìn)一步的細(xì)胞和分子生物學(xué)研究，可以實(shí)現(xiàn)在血管形態(tài)形成的細(xì)胞和分子調(diào)控機(jī)理研究領(lǐng)域的知識(shí)創(chuàng)新。（2）雖然以往的研究認(rèn)為Notch信號(hào)途徑在血管祖細(xì)胞的分化中作用不大，但本課題組的前期研究卻提示在成年小鼠Notch信號(hào)途徑有可能調(diào)控血管祖細(xì)胞的分化。本課題在此基礎(chǔ)上對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行進(jìn)一步研究和確認(rèn)，并探討其分子調(diào)控機(jī)理。有關(guān)研究尚未見報(bào)道。（3）以血管為靶向的藥物開發(fā)是治療包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的研究方向。本課題的研究將為這類應(yīng)用研究建立新的平臺(tái)并奠定進(jìn)一步研發(fā)的理論基礎(chǔ)。研究基礎(chǔ)和條件研究基礎(chǔ)：申請(qǐng)人近年來(lái)主要從事Notch信號(hào)途徑的功能和調(diào)控的研究。主要研究成就可概括為以下幾個(gè)方面：（1）首次建立了轉(zhuǎn)錄因子RBP-J的條件性基因剔除小鼠。表型分析表明，RBP-J可以介導(dǎo)Notch信