食用菌栽培與加工-02菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

第二章發(fā)酵的流程

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

第一節(jié)發(fā)酵的特點(diǎn)及流程

一、發(fā)酵的特點(diǎn)發(fā)酵和其他化學(xué)工業(yè)的最大區(qū)別在于它是生物體所進(jìn)行的化學(xué)反響。其主要特點(diǎn)如下：1、發(fā)酵過程一般來說都是在常溫常壓下進(jìn)行的生物化學(xué)反響，反響平安，要求條件也比較簡單。2、發(fā)酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農(nóng)副產(chǎn)品為主，只要參加少量的有機(jī)和無機(jī)氮源就可進(jìn)行反響。微生物因不同的類別可以有選擇地去利用它所需要的營養(yǎng)?；谶@—特性，可以利用廢水和廢物等作為發(fā)酵的原料進(jìn)行生物資源的改造和更新。3、發(fā)酵過程是通過生物體的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式來完成的，反響的專一性強(qiáng)，因而可以得到較為單—的代謝產(chǎn)物。4、由于生物體本身所具有的反響機(jī)制，能夠?qū)Ｒ恍缘睾透叨冗x擇性地對(duì)某些較為復(fù)雜的化合物進(jìn)行特定部位地氧化、復(fù)原等化學(xué)轉(zhuǎn)化反響，也可以產(chǎn)生比較復(fù)雜的高分子化合物。5、發(fā)酵過程中對(duì)雜菌污染的防治至關(guān)重要。除了必須對(duì)設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格消毒處理和空氣過濾外，反響必須在無菌條件下進(jìn)行。如果污染了雜菌，生產(chǎn)上就要遭到巨大的經(jīng)濟(jì)損失，要是感染了噬菌體，對(duì)發(fā)酵就會(huì)造成更大的危害。因而維持無菌條件是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。6、微生物菌種是進(jìn)行發(fā)酵的根本因素，通過變異和菌種篩選，可以獲得高產(chǎn)的優(yōu)良菌株并使生產(chǎn)設(shè)備得到充分利用，也可以因此獲得按常規(guī)方法難以生產(chǎn)的產(chǎn)品。7、工業(yè)發(fā)酵與其他工業(yè)相比，投資少，見效快，可以取得顯著的經(jīng)濟(jì)效益?；谝陨咸攸c(diǎn)，工業(yè)發(fā)酵日益引起人們重視。和傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝相比，現(xiàn)代發(fā)酵工程除了上述的發(fā)酵特征之外更有其優(yōu)越性。除了使用微生物外，還可以用動(dòng)植物細(xì)胞和酶，也可以用人工構(gòu)建的“工程菌’來進(jìn)行反響；反響設(shè)備也不只是常規(guī)的發(fā)酵罐，而是以各種各樣的生物反響器而代之，自動(dòng)化連續(xù)化程度高，使發(fā)酵水平在原有根底上有所提高和和創(chuàng)新。

二、發(fā)酵過程的組成局部1、發(fā)酵過程的組成除某些轉(zhuǎn)化過程外，典型的發(fā)酵過程可以劃分成六個(gè)根本組成局部：〔1〕繁殖種子和發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基組份設(shè)定；〔2〕培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備的滅菌；〔3〕培養(yǎng)有活性、適量的純種，接種入生產(chǎn)容器中；〔4〕微生物在最適合于產(chǎn)物生長的條件下，在發(fā)酵罐中生長；〔5〕產(chǎn)物萃取和精制；〔6〕過程中排出的廢棄物的處理。六個(gè)局部之間的關(guān)系如下圖。在建立發(fā)酵過程以前，首先要?jiǎng)e離出產(chǎn)生菌，并改進(jìn)菌種，使所產(chǎn)生的產(chǎn)物符合工業(yè)要求。3、發(fā)酵生產(chǎn)的條件

〔1〕某種適宜的微生物〔2〕保證或控制微生物進(jìn)行代謝的各種條件〔培養(yǎng)基組成，溫度，溶氧pH等〕〔3〕進(jìn)行微生物發(fā)酵的設(shè)備〔4〕提取菌體或代謝產(chǎn)物，精制成產(chǎn)品的方法和設(shè)備

第二節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

發(fā)酵罐容積幾百立方米。生產(chǎn)用種子是一個(gè)由實(shí)驗(yàn)室制備到車間生產(chǎn)的過程。其生產(chǎn)方法與條件隨不同的生產(chǎn)品種和菌種種類而異。如細(xì)菌、酵母菌、放線菌或霉菌生長的快慢；產(chǎn)孢子能力的大?。粻I養(yǎng)、溫度、需氧等條件要求均有所不同。種子擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)根據(jù)菌種的生理特性，選擇適宜的培養(yǎng)條件來獲得代謝旺盛、數(shù)量足夠的種子。種子接入發(fā)酵罐后，將使發(fā)酵生產(chǎn)周期縮短，設(shè)備利用率提高。種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵性的作用。種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍枯燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件：〔1〕菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，緩慢期短；〔2〕生理性狀穩(wěn)定；〔3〕菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；〔4〕無雜菌污染；〔5〕保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，種子制備的過程大致可分為兩個(gè)階段：〔1〕實(shí)驗(yàn)室種子制備階段〔2〕生產(chǎn)車間種子制備階段一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式：產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可用液體培養(yǎng)法?！惨弧虫咦拥闹苽?、細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富。培養(yǎng)溫度一般為37℃。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間1~2d，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)5~10d。2、霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25~28℃。培養(yǎng)時(shí)間一般為4~14d。3、放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和無機(jī)鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28℃。培養(yǎng)時(shí)間5~14d。〔二〕液體種子制備1、好氧培養(yǎng)對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌〔S.griseus〕可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐2、厭氧培養(yǎng)酵母菌〔啤酒，葡萄酒，清酒等〕其種子的制備過程如下：試管→三角瓶→卡式罐→種子罐例如:生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養(yǎng)基〔培養(yǎng)基配制：3g麥芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g葡萄糖和20g瓊脂于1L水中〕的斜面上，于4℃冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。將保存的酵母菌種接入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2-3d。再擴(kuò)大至含有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2d.移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20℃培養(yǎng)3-5d即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定時(shí)搖動(dòng)或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。二、生產(chǎn)車間種子制備種子罐的培養(yǎng)基因不同菌種而異，但其原那么為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，需氧菌，還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌〔絲〕體在培養(yǎng)液中均勻分布。1、種子罐的作用使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌〔絲〕體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，到達(dá)一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。2、種子罐級(jí)數(shù)確實(shí)定種子罐級(jí)數(shù)：是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：〔1〕菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；〔2〕所采用發(fā)酵罐的容積。比方：細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵孢子懸浮液→一級(jí)種子罐〔27℃,40h孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲〕→二級(jí)種子罐〔27℃，10~24h，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體〕→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級(jí)發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子3、確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問題〔1〕種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌時(shí)機(jī)〔2〕種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌時(shí)機(jī)〔3〕雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。第三節(jié)種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間等。1、培養(yǎng)基種子質(zhì)量不穩(wěn)定的主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。例如：在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對(duì)孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對(duì)孢子影響不同。原材料質(zhì)量的波動(dòng)，也會(huì)影響孢子質(zhì)量。如微量元素Mg2+

、Cu2+

、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量。水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動(dòng)，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決措施：〔1〕培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用；〔2〕嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；〔3〕斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間；〔4〕供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或別離用的培養(yǎng)基那么采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。2、培養(yǎng)條件〔1〕溫度如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37℃培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮上升提前，菌絲過早自溶，效價(jià)降低等現(xiàn)象。一般要嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。〔2〕濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子數(shù)量和質(zhì)量有較大影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子制備時(shí)發(fā)現(xiàn)：氣候枯燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。表2-1不同相對(duì)濕度對(duì)龜裂鏈霉菌斜面生長的影響相對(duì)濕度（%）斜面外觀活孢子計(jì)數(shù)（億/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄下部稠略黃上部薄中部均勻發(fā)白一片白，孢子豐富，稍皺1.22.35.73、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間〔1〕培養(yǎng)時(shí)間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。解決措施：孢子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。〔2〕冷藏時(shí)間斜面冷藏對(duì)孢子質(zhì)量影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4d左右即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8d菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5d以后冷藏，20d未發(fā)現(xiàn)自溶。

冷藏時(shí)間對(duì)孢子生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6℃冷藏兩個(gè)月后發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月降低18%，冷藏3個(gè)月后降低35%。4、接種量接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。也影響到菌種的適應(yīng)期。

二、影響種子質(zhì)量的因素及控制生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。1、培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要滿足以下要求：〔1〕營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要〔2〕選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；〔3〕營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；〔4〕營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高〔5〕營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2、培養(yǎng)條件〔1〕溫度〔2〕通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和缺乏兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子罐的通氣量小對(duì)發(fā)酵有利。3、種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對(duì)數(shù)生長期，菌體量還未到達(dá)最大值時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間較為適宜。時(shí)間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實(shí)驗(yàn)來確定。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時(shí)最好〔見以下圖〕。4、接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖到達(dá)頂峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長時(shí)機(jī)。但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵。過大會(huì)引起溶氧缺乏，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細(xì)菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時(shí)20~25%

三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生產(chǎn)過程中通常進(jìn)行以下兩項(xiàng)檢查?！?〕菌種穩(wěn)定性的檢查〔2〕無〔雜菌〕檢查四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、細(xì)胞或菌體菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀〔色素、顆粒等〕單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。2、生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。3、產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。4、酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。

五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢菌絲結(jié)團(tuán)菌絲粘壁感染噬菌體第四節(jié)實(shí)例一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐1、斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對(duì)純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原那么。(1)斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0~2.5%，pH7.0~7.2〔傳代和保藏斜面不加葡萄糖〕。(2)培養(yǎng)條件33~34℃，培養(yǎng)18~24h。2、一級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。(1)培養(yǎng)基組成葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0.1%，玉米漿2.5~3.5%(按質(zhì)增減)，硫酸亞鐵、硫酸錳各2ppm，pH7.0。(2)培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度33~34℃。(3)一級(jí)種子質(zhì)量要求種齡：12h，pH值：6.4±0.1光密度：凈增OD值0.5以上殘?zhí)牵?.5％以下無菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反響。3、二級(jí)種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級(jí)種子培養(yǎng)的根底上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級(jí)種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。(1)培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成（%）T6-13B9T738AS1.299水解糖玉米漿磷酸氫二鉀硫酸鎂尿素Fe++（ppm）Mn++（ppm）pH2.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.20.050.5227.02.52.50.10.040.5226.5-6.8(2)培養(yǎng)條件接種量：0.8~1.0％培養(yǎng)溫度：32~34℃培養(yǎng)時(shí)間：7~8h通風(fēng)量：50L種子罐1:0.5攪拌轉(zhuǎn)速340r／min；250L種子罐1:0.3攪拌轉(zhuǎn)速300r／min500L種子罐1:0.25攪拌轉(zhuǎn)速230r／min(3)二級(jí)種子的質(zhì)量要求種齡：7~8hpH：7.2左右OD值凈增0.5左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)二、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)一般可采用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第1級(jí)到第2級(jí)為8-10倍，第2級(jí)到第3級(jí)為4-6倍。1、實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)

第五節(jié)生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個(gè)方面：從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個(gè)種子罐；從一個(gè)種子罐移入另一個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中?！?〕從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器接種通常有兩種方式第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種的保藏1、菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的根本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成局部。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。常用的要求：低溫、隔氧、枯燥2、菌種保藏的目的菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，枯燥和低溫，使菌種處于“休眠〞狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。3、菌種保藏的方法〔1〕斜面低溫保藏法將菌株接種于適宜斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于4冰箱保藏，每隔一定時(shí)間進(jìn)行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。其缺點(diǎn)是菌種仍有一定強(qiáng)度的代謝活動(dòng)條件，保存時(shí)間不長，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異?！?〕石蠟油封保藏法將生長好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內(nèi)保藏即可。這種方法也比較簡便，且保藏時(shí)間一般可長達(dá)l年以上。適于保存局部霉菌、酵母菌、放線菌，但對(duì)細(xì)菌效果較差，對(duì)某些能同化烴類的微生物那么不適用?！?〕砂土管保藏法將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土管中，于真空枯燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有枯燥劑的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于細(xì)菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對(duì)枯燥敏感的無芽孢的細(xì)菌和酵母菌。主要包括砂土制備和真空抽干兩步?！?〕冷凍枯燥法此法的原理是在低溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動(dòng)處于極低水平，不易發(fā)生變異和死亡，因而能長期保存，一般為5~10年。微生物在此條件下易死亡，所以需參加一些物質(zhì)作保護(hù)劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細(xì)菌〔有芽孢和無芽孢的〕、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。其缺點(diǎn)是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴(yán)格，并需有一定設(shè)備條件?！?〕超低溫保藏法由于現(xiàn)在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的超低溫保藏法在生產(chǎn)企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)已得到廣泛應(yīng)用。該方法的要點(diǎn)是：將要保藏的菌種置于10%甘油或二甲基亞砜保護(hù)劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于-70℃下保藏。該法簡便易行，而且保藏效果較好。二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯微生物具有生命活動(dòng)能力，其世代時(shí)間一般是很短的，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有可能使優(yōu)良菌種喪失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題?！惨弧澄⑸锞N的衰退菌種退化是指在較長時(shí)期傳代保藏后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。常見的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。在生理上常指菌種發(fā)酵能力的降低，有些菌的抗噬菌體能力下降。對(duì)誘變育種而獲得的高產(chǎn)變異株那么常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。菌種的真正退化必須與由于環(huán)境原因變化而引起菌種形態(tài)、和生理上的變異區(qū)別開來。如培養(yǎng)基中微量元素缺乏會(huì)導(dǎo)致孢子數(shù)量減少，也會(huì)引起孢子顏色的改變。此外，溫度、pH、不同碳氮源都會(huì)導(dǎo)致菌種變化。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象就會(huì)消失。雜菌污染也會(huì)造成菌種退化的假象。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出正確的解決方法。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時(shí)也是整個(gè)群體中產(chǎn)量降低及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個(gè)細(xì)胞的改變。引起菌種退化的原因主要有：1、基因突變菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變那么會(huì)引起產(chǎn)量下降，如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變那么孢子性能就會(huì)下降。當(dāng)然，這些負(fù)突變都是自發(fā)形成的。經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞比休眠狀態(tài)細(xì)胞發(fā)生突變的機(jī)率大得多。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營養(yǎng)缺陷型突變株，如缺陷型發(fā)生回復(fù)突變就會(huì)使產(chǎn)量水平下降。如粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratiamarcescens)H-2892菌株生產(chǎn)力為18g/L組氨酸，經(jīng)5次傳代后因回復(fù)突變型增多，產(chǎn)量下降至4g/L。很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都局部或全部受質(zhì)粒基因控制。當(dāng)菌株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，那么生產(chǎn)能力也顯著下降。2、變異菌株性狀別離變異菌株性狀別離也會(huì)引起高產(chǎn)性狀的喪失。在菌種篩選工作中初篩搖瓶產(chǎn)量很高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。當(dāng)誘變的單菌落是由一個(gè)以上孢子或細(xì)胞形成，而其中只有一個(gè)孢子或細(xì)胞是高產(chǎn)時(shí)，在移接傳代過程中，這個(gè)高產(chǎn)菌株數(shù)量減少，當(dāng)然產(chǎn)量也就下降。菌落是由一個(gè)孢子或單個(gè)細(xì)胞形成，只要它是多核細(xì)胞，在誘發(fā)突變中核的變化不會(huì)都一樣，隨著菌種傳代和核的別離也會(huì)使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會(huì)隨之變化。

單核孢子發(fā)生突變時(shí)，如果雙鏈DNA上僅一條鏈上某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會(huì)出現(xiàn)性狀別離。因此一個(gè)較穩(wěn)定的變異株的獲得必須經(jīng)過屢次別離純化。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細(xì)胞DNA雙鏈中一條鏈的某一點(diǎn)發(fā)生突變，另一條鏈完全失活不再復(fù)制來提高純菌產(chǎn)生率。3、連續(xù)傳