新版dpph自由基清除實(shí)驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)流程圖-操作圖解-李熙燦-Xican-Li

DPPH自由基清除/PTIO自由基清除實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)流程圖2018.4【前言】體內(nèi)（細(xì)胞內(nèi)）的自由基，可以分為兩類(lèi)：活性氧（ROS，Reactiveoxygenspecies）和活性氮（RNS，Reactivenitrogenspecies）。ROS主要有羥基自由基·OH，過(guò)氧自由基(·O2-)，脂質(zhì)過(guò)氧自由基(LOO·)等；RNS主要有一氧化氮（·NO）等。這些ROS和RNS如果過(guò)量堆積，會(huì)引起氧化應(yīng)激，發(fā)生各種病變，加速機(jī)體衰老。許多植物（特別是中藥），對(duì)ROS和RNS都有較強(qiáng)的清除作用，這種清除作用可以緩解氧化應(yīng)激，故稱(chēng)為抗氧化。為了評(píng)價(jià)抗氧化活性的強(qiáng)弱，生物化學(xué)家建立了一系列的評(píng)價(jià)方法。最常見(jiàn)的是DPPH自由基清除法。DPPH自由基結(jié)構(gòu)如下：其全稱(chēng)有數(shù)個(gè)：（1）1,1-二苯基-2-三硝基苯肼基自由基；（2）1,1-二苯基-2-苦肼基自由基；（3）2,2-二苯基-1-苦肼基自由基；（4）2,2-二苯基-1-三硝基苯肼基自由基；（5）α,α-二苯基-β-苦肼基自由基。盡管如此，其簡(jiǎn)稱(chēng)都是“DPPH自由基”。RNS和ROS都是不穩(wěn)定的（如·OH，·O2-，LOO·，·NO），很難直接評(píng)價(jià)。不過(guò)，DPPH自由基較穩(wěn)定，因?yàn)镹原子上那個(gè)成單電子，可以與苯環(huán)形成p-π共軛。穩(wěn)定的DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫紅色，并在519nm范圍有最大吸收峰。當(dāng)向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑(抗氧化劑)時(shí)，成單被配對(duì)，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H分子，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可以通過(guò)吸光度的變化進(jìn)行定量分析。當(dāng)DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)后，519nm波長(zhǎng)處的吸收值降低，其降低的程度與接收的電子（抗氧化劑清除自由基活性）呈定量關(guān)系，可以用分光光度計(jì)測(cè)定。不過(guò)，從結(jié)構(gòu)式中可以看也，其成單電子位于N原子上，所以，是RNS而不是ROS。所以，嚴(yán)格講，DPPH法只能用于評(píng)價(jià)RNS清除水平而不是ROS清除水平。如果要評(píng)價(jià)ROS清除水平，必須用相對(duì)穩(wěn)定的氧自由基。PTIO自由基，即是一種相對(duì)穩(wěn)定的氧自由基。由結(jié)構(gòu)式可知，PTIO自由基的成單電子是位于氧原子上的，而且，旁邊有大的π-π共軛體系，所以，其結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。其甲醇溶液呈深紫色，并在586nm范圍有最大吸收峰；其水溶液呈深紫色，并在557nm范圍有最大吸收峰。所以，既可以用水作溶劑，也可以用甲醇作溶劑。具體，則視樣品的溶解性而定。如果能將DPPH自由基清除和PTIO自由基清除相結(jié)合，則既能反映RNS清除水平，又能反映ROS清除水平。故，可以較全面地評(píng)價(jià)其抗氧化活性?！疚墨I(xiàn)】XicanLi.2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-oxide(PTIO?)Radical-scavenging:ANewandSimpleAntioxidant.Jour