真核細胞常見表達載體

真核細胞常見表達載體1.pCMVp-NEO-BAN載體

特點:該真核細胞表達載體分子量為6600堿基對，主要由CMVp啟動子、兔β-球蛋白基因內(nèi)含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架構(gòu)成，在大多數(shù)真核細胞內(nèi)都能高水平穩(wěn)定地表達外源目的基因。更重要的是，由于該真核細胞表達載體中抗neo基因存在，轉(zhuǎn)染細胞后，用G418篩選，可建立穩(wěn)定的、高表達目的基因的細胞株。

插入外源基因的克隆位點包括Sal1、BamH1和EcoR1位點。注意在此載體中有二個EcoR1位點存在。

2.pEGFP,

增強型絳色熒光蛋白表達載體(EnhancedFluorecentProteinVector)

特點:pEGFP表達載體中含有綠色熒光蛋白，在PCMV啟動子驅(qū)動下，在真核細胞中高水平表達。載體骨架中的SV40origin使該載體在任何表達SV40T抗原的真核細胞內(nèi)進行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細胞株。此外，載體中的pUCorigin能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制，而位于此表達盒上游的細菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達。

用途:該表達載體EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位點，將外源基因扦入這些位點，將合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可確定外源基因在細胞內(nèi)的表達和/或組織中的定位。

亦可用于檢測克隆的啟動子活性(取代CMV啟動子,Acet1-Nhe1)。

Excitationmaximum=488nm;Emissionmaximum=507

圖示為啟動子分泌信號肽和多克隆位點區(qū)域：

Ase1.pCMV…ccgctagcgctaccggtcgccaccatg-.EGFP…BamH1…SV40polyA+

Nhe1

Age1

3.

pEGFT-Actin,增強型綠色熒光蛋白/人肌動蛋白表達載體

特點:pEGFP-Actin表達載體中含有綠色熒光蛋白和人胞漿β-肌動蛋白基因，在PCMV啟動子驅(qū)動下，在真核細胞中高水平表達。載體骨架中的SV40origin使該載體在任何表達SV40T抗原的真核細胞內(nèi)進行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細胞株。此外，載體中的pUCorigin能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制，而位于此表達盒上游的細菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達。

用途:pEGFP-Actin載體在真核細胞表達EGFP-Actin融合蛋白，該蛋白能整合到胞內(nèi)正在生的肌動蛋白，因而在活細胞和固定細胞中觀察到細胞內(nèi)含肌動蛋白的亞細胞結(jié)構(gòu)。

Excitationmaximum=488nm;

Emissionmaximum=507

圖示為啟動子和多克隆位點區(qū)域：

pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40polyA+

4.pSV2表達載體

特點：該表達質(zhì)粒是以病責(zé)SV40啟動子驅(qū)動在真核細胞目的基因進行表達的，克隆位點為Hind111。SV40啟動子具有組織/細胞的選擇特異性。此載體不含neo基因，故不能用來篩選、建立穩(wěn)定的表達細胞株。

圖示為啟動子和多克隆位點區(qū)域：

Pvu11…pSV40….Hind111….SV40IVS….SV40polyA+

5．CMV4表達載體

特點:該真核細胞表達載體由CMV啟動子驅(qū)動，多克隆區(qū)域酶切位點選擇性較多。含有氨芐青霉素抗性基因和生長基因以及SV40復(fù)制原點和fl單鏈復(fù)制原點。但值得注意的是，該表達載體不含有neo基因，轉(zhuǎn)染細胞后不能用G418篩選穩(wěn)定的表達細胞株。

圖示為啟動子和多克隆位點區(qū)域：

CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40ori

其他常用克隆Vector：

pBluscriptIIKSDNA

15ug

pUC18DNA

25ug

pUC19DNA

25ug

說明:

pBluescriptIIkS、pUC18&Puc19載體適合于DNA的克隆、DNA測序和對外源基因進行表達等。這些載體由于在lacZ基因中含有多克隆位點，當外源DNA扦入，轉(zhuǎn)化lacZ基因缺乏細胞，并在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，含有外源DNA載體的細胞將為白色菌落，而無外源DNA載體的細胞則為蘭色菌落，由此易于篩選有無外源DNA的載體。此外，這些載體中有便于測序的M13、T7和T3的通用引物進行DNA測序。

保存液:TEBuffer

TEBuffer組成:

10mMTris.HCL(Ph8.0)真核細胞表達外源基因的調(diào)控1．真核基因組的復(fù)雜性

與原核生物比較，真核生物的基因組更為復(fù)雜，可列舉如下。

（1）真核基因組比原核基因組大得多，大腸桿菌基因組約4×106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級，比細菌大千倍；大腸桿菌約有4000個基因，人則約有10萬個基因。

（2）真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達調(diào)控的層次和復(fù)雜性。

（3）原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體。

（4）如前所述，細菌多數(shù)基因按功能相關(guān)成串排列，組成操縱元的基因表達調(diào)控的單元，共同開啟或關(guān)閉，轉(zhuǎn)錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱元的結(jié)構(gòu)，而真核細胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構(gòu)成的，這就涉及到多個基因協(xié)調(diào)表達的問題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達要比原核生物復(fù)雜得多。

（5）原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實驗表明：哺乳類基因組中僅約10%的序列為蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。

（6）原核生物的基因為蛋白質(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接(splicing)去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié)。

（7）原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳動物基因組中則存在大量重復(fù)序列(repetitivesequences)。用復(fù)性動力學(xué)等實驗表明有三類重復(fù)序列：①高度重復(fù)序列(highlyrepetitivesequences)，這類序列一般較短，長10－300bp，在哺乳類基因組中重復(fù)106次左右，占基因組DNA序列總量的10－60%，人的基因組中這類序列約占20%，功能還不明了。②中度重復(fù)序列(moderatelyrepetitivesequences)，這類序列多數(shù)長100－500bp，重復(fù)101－105次，占基因組10-40%。例如哺乳類中含量最多的一種稱為Alu的序列，長約300bp，在哺乳類不同種屬間相似，在基因組中重復(fù)3-×105次，在人的基因組中約占7%，功能也還不很清楚。在人的基因組中18S/28SrRNA基因重復(fù)280次，5SrRNA基因重復(fù)2000次，tRNA基因重復(fù)1300次，5種組蛋白的基因串連成簇重復(fù)30-40次，這些基因都可歸入中度重復(fù)序列范圍。③單拷貝序列(singlecopysequences)。這類序列基本上不重復(fù)，占哺乳類基因組的50-80%，在人基因組中約占65%。絕大多數(shù)真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因在單倍體基因組中都不重復(fù)，是單拷貝的基因。

從上述可見真核基因組比原核基因組復(fù)雜得多，至今人類對真核基因組的認識還很有限，使現(xiàn)在國際上制訂的人基因組研究計劃(humangeneproject)完成，繪出人全部基因的染色體定位圖，測出人基因組109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互關(guān)系，特別是要明了基因表達調(diào)控的全部規(guī)律，還需要經(jīng)歷很長期艱巨的研究過程。

2．真核基因表達調(diào)控的特點

盡管我們現(xiàn)在對真核基因表達調(diào)控知道還不多，但與原核生物比較它具有一些明顯的特點。

（1）真核基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié)更多

如前所述，基因表達是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個過程。同原核生物一樣，轉(zhuǎn)錄依然是真核生物基因表達調(diào)控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細胞核(線粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線粒體內(nèi))，翻譯則多在胞漿，兩個過程是分開的，因此其調(diào)控增加了更多的環(huán)節(jié)和復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控占有了更多的分量。圖1扼要地列出真核基因表達的各個可能的環(huán)節(jié)。

圖1真核生物基因表達調(diào)控的可能環(huán)節(jié)

圖1總結(jié)了以前章節(jié)敘述過的基因表達過程，并作了一些新補充。圖中標出了真核細胞在分化過程中會發(fā)生基因重排(generearrangement)，即胚原性基因組中某些基因會再組合變化形成第二級基因。例如編碼完整抗體蛋白的基因是在淋巴細胞分化發(fā)育過程中，由原來分開的幾百個不同的可變區(qū)基因經(jīng)選擇、組合、變化，與恒定區(qū)基因一起構(gòu)成穩(wěn)定的、為特定的完整抗體蛋白編碼的可表達的基因。這種基因重排使細胞可能利用幾百個抗體基因的片段，組合變化而產(chǎn)生能編碼達108種不同抗體的基因，其中就有復(fù)雜的基因表達調(diào)控機理。

此外，真核細胞中還會發(fā)生基因擴增(geneamplification)，即基因組中的特定段落在某些情況下會復(fù)制產(chǎn)生許多拷貝。最早發(fā)現(xiàn)的是蛙的成熟卵細胞在受精后的發(fā)育過程中其rRNA基因(可稱為rDNA)可擴增2000倍，以后發(fā)現(xiàn)其他動物的卵細胞也有同樣的情況，這很顯然適合了受精后迅速發(fā)育分裂要合成大量蛋白質(zhì)，需要有大量核糖體。又如MTX(methotrexate)是葉酸的結(jié)構(gòu)類似物，一些哺乳類細胞會對含有利用葉酸所必需的二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因的DNA區(qū)段擴增40?00倍，使DHFR的表達量顯著增加，從而提高對MTX的抗性?；虻臄U增無疑能夠大幅度提高基因表達產(chǎn)物的量，但這種調(diào)控機理至今還不清楚。

（2）真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)

真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內(nèi)與組蛋白等結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)中NA和組蛋白的結(jié)構(gòu)狀態(tài)都影響轉(zhuǎn)錄，至少有以下現(xiàn)象：

1）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄細胞分裂時染色體的大部分到間期時松開分散在核內(nèi)，稱為常染色質(zhì)(euchromatin)，松散的染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)(heterochromatin)，其中從未見有基因轉(zhuǎn)錄表達；原本在常染色質(zhì)中表達的基因如移到異染色質(zhì)內(nèi)也會停止表達；哺乳類雌體細胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質(zhì)者，這條X染色體上的基因就全部失活?？梢娋o密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止基因表達。真核細胞表達外源基因技術(shù)1．生化方法

（1）磷酸鈣介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染真核細胞

1）轉(zhuǎn)染前24h，通過胰酶消化收集細胞，用適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基以1×105至4×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于60mm組織培養(yǎng)皿或12孔板上。于含5%～7%CO2的37℃溫箱孵育20～24h。轉(zhuǎn)染前1h換液。

2）按照下屬方法制備磷酸鈣-DNA沉淀：于5ml滅菌塑料管內(nèi)混合100μl2.5mol/LCaCl2與25μg質(zhì)粒DNA，如有必要用0.1×TE（pH7.6）將體積補至1ml。室溫下將以上2×鈣-DNA溶液與等體積的2×HEPES鹽溶液混合。迅速彈敲試管側(cè)壁混勻溶液，靜置1min。

3）立即將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至上述單層細胞的細胞培養(yǎng)基中。每1ml培養(yǎng)基加0.1ml懸液。輕輕搖動平皿混勻培養(yǎng)基，培養(yǎng)基會變成混濁的橘黃色。一旦形成DNA沉淀，轉(zhuǎn)染效率會大大降低，因此此步動作應(yīng)盡可能迅速。如果是用氯喹、甘油與/或丁酸鈉處理細胞，直接進行步驟5。

4）如果轉(zhuǎn)染的細胞不用轉(zhuǎn)染促進劑處理，則置于含5%~7%CO2的37℃溫箱孵育。2～6h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀。加入5ml37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，將細胞放回孵箱孵育1～6天。繼續(xù)步驟6檢測轉(zhuǎn)染DNA的瞬時表達，或者如果是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化則直接進行步驟7。

5）在磷酸鈣-DNA沉淀物的存在下用氯喹處理細胞或者吸去沉淀溶液后將細胞暴露于甘油與丁酸鈉中會促進細胞吸收DNA。

（2）用氯喹處理細胞

氯喹是一種弱堿，推測是通過抑制細胞內(nèi)溶酶體水解酶降解DNA而發(fā)揮作用（LuthmanandMagnusson1983）。細胞對氯喹毒性的敏感度限制了培養(yǎng)基中加入氯喹的濃度及時間，不同細胞所需氯喹最佳濃度根據(jù)經(jīng)驗而定。

1）在把磷酸鈣-DNA沉淀物加入細胞前或后按1：1000將100mmol/L氯喹直接加入培養(yǎng)基中。

2）細胞于含5%~7%CO2的37℃溫箱中孵育3~5h。

3）在用DNA于氯喹孵育細胞后，移去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，加5ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。細胞于孵箱中培養(yǎng)1～6天。繼續(xù)步驟6檢測轉(zhuǎn)染DNA的瞬時表達，或者直接進行步驟7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

（3）丁酸鈉處理細胞

丁酸鈉的作用機制并不確定；但它是組蛋白乙?；纬墒雇鈦碣|(zhì)粒DNA趨于轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（WorkmanandKingston1998）。

1）甘油休克處理后，將500mmol/L丁酸鈉直接加入生長培養(yǎng)基（甘油處理的步驟d）。細胞類型不同，所用丁酸鈉的濃度也不同。例如：

CV-1

10mmol/L

NIH-3T3

7mmol/L

HeLa

5mmol/L

CHO

2mmol/L

其他細胞系所需濃度依經(jīng)驗而定。

2）細胞于孵箱中培養(yǎng)1~6天。繼續(xù)步驟6檢測轉(zhuǎn)染DNA的瞬時表達，或者直接進行步驟7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

6）若要檢測細胞轉(zhuǎn)染后導(dǎo)入DNA的瞬時表達，可在轉(zhuǎn)染后1~6天收獲細胞。雜交分析DNA或RNA。通過體內(nèi)代謝標記進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。

7）分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體

(1)用非選擇性培養(yǎng)基孵育細胞24~48h，使轉(zhuǎn)染的DNA有足夠時間表達。

(2)胰酶消化細胞并重鋪細胞于選擇性培養(yǎng)基中，或者直接加選擇性培養(yǎng)基/

(3)每2~4天更換培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2~3周，目的是清除死細胞殘骸，促進抗性細胞生長。

(4)克隆獨立菌路、繁殖，以用于檢測（方法見JakobyandPastan1979或Spectoretal.1998b[《細胞試驗手冊》的第86章]）。

(6)用預(yù)冷的甲醇固定細胞15min，然后室溫下用10%Giemsa染色15min，流水沖洗，這樣可以記錄細胞克隆數(shù)目。

2．物理方法

（1）電穿孔轉(zhuǎn)染DNA

1）細胞生長到對數(shù)中期或晚期時收集細胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶釋放貼壁細胞。4℃、500g離心5min（SorvallH1000B轉(zhuǎn)子用1500r/min）.

2）用0.5體積的初始培養(yǎng)基重懸細胞，用血細胞計數(shù)器計細胞數(shù)目。

3）離心（同步驟1）收集細胞，室溫下用培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液重懸細胞至2.5×106~2.5×107細胞/ml。

4）將400μl的各等份細胞懸液（106～107細胞）加入標記好的電轉(zhuǎn)化池中，冰浴。

5）設(shè)置電轉(zhuǎn)化參數(shù)。一般電容量為1050μF。電壓在200V和250V之間，不同細胞系所需電壓不同，平均為260V。內(nèi)部阻抗設(shè)為無窮大。進行電穿孔前先用一個裝有PBS的電轉(zhuǎn)化池放電至少兩次。

6）每一裝有細胞的電轉(zhuǎn)化池內(nèi)加入10～30μg、體積最大可至40μl的質(zhì)粒DNA。用吸管將DNA與細胞輕輕混勻。立刻繼續(xù)進行第7步。

7）立即將電轉(zhuǎn)化池移至電極間放電，1～２min后，取出電轉(zhuǎn)化池，水浴，立即進行下一步操作。

8）用帶有高壓滅菌吸頭的微量移液器將電穿孔的細胞轉(zhuǎn)移至35mm培養(yǎng)皿中。用等體積的培養(yǎng)基洗滌電轉(zhuǎn)化池，洗液加入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿置于含5%～7%CO2的37℃孵箱。

9）重復(fù)第6～8步，電轉(zhuǎn)化所有DNA與細胞樣品。記錄下每一電轉(zhuǎn)化池的實際脈沖時間以便于比較?，F(xiàn)已分離出有作用的真核細胞可誘導(dǎo)性表達元件有多種，如重金屬離子誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動子，具有正負調(diào)控作用的糖皮質(zhì)激素啟動子及干擾素誘導(dǎo)的啟動子系統(tǒng)等。將這些啟動子元件與目的基因融合構(gòu)成轉(zhuǎn)基因，?？杀憩F(xiàn)出相應(yīng)基因的可誘導(dǎo)性表達。．哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠勝于原核表達系統(tǒng)及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動物細胞表達載體包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。

將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎饕ㄟ^2類方法：一是感染性病毒顆粒感染宿主細胞，二是通過脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊毎小Ｍ庠椿虻捏w外表達一般采用質(zhì)粒表達載體，如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細胞可建立高效穩(wěn)定的表達系統(tǒng)，而利用COS細胞可建立瞬時表達系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動物體內(nèi)表達外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當大(約187kb)，利用它作為載體可同時插入幾種外源基因，從而構(gòu)建多價疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高，某些難轉(zhuǎn)染的細胞系也可通過其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合入宿主細胞染色體，具有潛在的危險性。

由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構(gòu)建的載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細胞內(nèi)的這種同源重組效率很低，利用細菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。另一種方法是通過CrelaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入laxP位點，然后將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞，通過Cre介導(dǎo)兩個laxP位點之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中插入巨細胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動物細胞中不會引起病毒基因的表達，而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進行基因轉(zhuǎn)移為我們提供了很好的途徑。

利用哺乳動物細胞表達外源基因時，大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo)，但當表達產(chǎn)物對細胞有毒性時應(yīng)采取誘導(dǎo)，這樣可避免表達產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對細胞產(chǎn)生影響。哺乳動物細胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與啟動子有關(guān)如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導(dǎo)表達特異性差；當系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時表達有泄漏誘導(dǎo)劑本身有毒性，常對細胞造成損傷等。

為此，Gossen等構(gòu)建了受四環(huán)素負調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒中具有編碼轉(zhuǎn)錄激活因子(fIA)的序列，在沒有四環(huán)素或強力毒素存在的情況下tTA可引起下游目的基因表達。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒有四環(huán)素的情況下啟動子不被激活，而在加入四環(huán)素或強力毒素后目的基因高效表達。四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動物細胞誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴密、高效可控制性強的優(yōu)點。

外源蛋白的表達會對哺乳動物細胞產(chǎn)生不利影響，因此利用哺乳動物細胞表達外源基因時，一個主要問題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達。Mielke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動物中穩(wěn)定表達異二聚體蛋白的載體系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈