藥典三部(2015版)-通則-3407外源性DNA殘留量測定法

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外源性DNA殘留量測定法在進行外源性DNA殘留量測定時，可根據(jù)供試品具體情況選擇下列任何一種方法進行測定。第一法

DNA探針雜交發(fā)供試品中的外源性DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上，在一定條件下可與相匹配的單鏈DNA復性而重新結(jié)合成為雙鏈DNA，稱為雜交。將特異性單鏈DNA探針標記后，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，并使用與標記物相應的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性DNA對照比對后，可測定供試品中外源性DNA殘留量。試劑

⑴DNA標記和檢測試劑盒⑵DNA雜交膜

尼龍膜或硝酸纖維素膜。⑶2%蛋白酶K溶液

稱取蛋白酶K0.20g，溶于滅菌水（電阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中，分裝后貯藏于﹣20℃?zhèn)溆谩＂?%牛血清白蛋白溶液

稱取牛血清白蛋白0.30g，溶于滅菌水（電阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中。⑸1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）

用適宜濃度鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0。⑹5.0mol/L氯化鈉溶液。⑺0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）

用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8.0。⑻20%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液

用鹽酸調(diào)pH值至7.2。⑼蛋白酶緩沖液（pH8.0）

量取1mol/LTris溶液1.0ml（pH8.0）、5.0mol/L氯化鈉溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）2.0ml、20%SDS溶液2.5ml、加滅菌水（電阻率大于18.2MΩ·cm）至10ml。如供試品遇氯化鈉溶液發(fā)生沉淀反應，可免加氯化鈉。⑽TE緩沖液（pH8.0）

量取1mol/LTris溶液（pH8.0）10ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）2ml，加滅菌水（電阻率大于18.2MΩ·cm）至1000ml。⑾1%魚精DNA溶液

精密稱取魚精DNA0.10g，置10ml量瓶中，用TE緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖晃，用7號針頭反復抽打，以剪切DNA成為小分子，分裝后貯藏于﹣20℃?zhèn)溆?。⑿DNA稀釋液

取1%魚精DNA溶液50μl，加TE緩沖液至10ml。用于探針標記和陽性對照的DNA制備

用于探針標記和陽性對照的DNA，由生產(chǎn)供試品用的傳代細胞、工程菌或雜交瘤細胞提取純化獲得，其提純和鑒定可參考下述推薦方案進行，具體方法可參考《分子克隆實驗指南》（［美］J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002）或《精編分子生物學實驗指南》（［美］F.奧斯伯等著，顏子穎、王海林譯，科學出版社，1998）。將待提取的細胞基質(zhì)懸液的細胞濃度調(diào)整為每1ml約含107個細胞，如果為細菌，則將其濃度調(diào)整為每1ml約含108個細胞。量取懸液1ml，離心，在沉淀中加裂解液400ul混勻，37℃作用12～24小時后，加入飽和苯酚溶液450μl，劇烈振搖混勻，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液體，以飽和苯酚溶液450μl重復抽提1次；轉(zhuǎn)移上層液體，加入三氯甲烷450μl，劇烈振搖混勻，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；轉(zhuǎn)移上層液體，加入pH5.2的3mol/L醋酸鈉溶液40μl，充分混合，再加入﹣20℃以下的無水乙醇1ml，充分混合，﹣20℃以下作用2小時，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘；用適量﹣20℃70%乙醇溶液洗滌沉淀1次，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加適量滅菌TE緩沖液溶解，RNase酶切，苯酚-三氯甲烷抽提，分子篩純化DNA，即得。用1%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法鑒定陽性對照品的DNA純度；應無RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值應在1.8～2.0之間（測定時將供試品稀釋至A260為0.2～1.0）。用于陽性對照和標記探針的DNA在使用前應進行酶切或超聲處理，使其片段大小適合于DNA雜交和探針標記。陽性對照品的DNA濃度按下式計算：DNA濃度（μg/ml）=50×A260陽性對照品可分裝于適宜的小管中，﹣20℃以下保存，長期使用。探針的標記

按試劑盒使用說明書進行。測定法

⑴蛋白酶K預處理

按下表對供試品、陽性對照和陰性對照進行加樣，混合后于37℃保溫4小時以上，以保證酶切反應完全。

加樣量2%蛋白酶K溶液蛋白酶緩沖液3%牛血清白蛋白溶液加水至終體積供試品100μl1μl20μl

200μlD1100μl1μl20μl適量200μlD2100μl1μl20μl適量200μlD3100μl1μl20μl適量200μl陰性對照100μl1μl20μl適量200μl

注意事項

供試品的稀釋根據(jù)成品最大使用劑量，用DNA稀釋液將供試品（原液）稀釋至每100μl含1人份劑量；如成品最大使用劑量較大，而供試品的蛋白質(zhì)含量較低，可用DNA稀釋液將供試品稀釋至每100μl含1/10人份劑量或每100μl含1/100人份劑量。D1、D2、D3為稀釋的陽性DNA對照。用DNA稀釋液稀釋至每1ml中含DNA1000ng，然后依次10倍稀釋成10ng/100μl（D1）、1ng/100μl（D2）、100pg/100μl（D3）3個稀釋度；如成品使用劑量較大，而且DNA限量要求（100pg/劑量）較嚴格時，則需要提高DNA檢測靈敏度，相應的陽性DNA對照應稀釋成100pg/100ul（D1）、10pg/100ul（D2）、1pg/100ul（D3）三個稀釋度。陰性對照為DNA稀釋液，空白對照為未進行蛋白酶K預處理的TE緩沖液。當供試品1/100人份劑量大于100μl時，終體積也隨之增大，一般終體積為供試品體積的1倍左右，供試品體積和終體積相差過小，可能會影響蛋白酶K的活性。2%蛋白酶K溶液和蛋白酶緩沖液的比例為1︰20，蛋白酶緩沖液和終體積的比例為1︰10。加入3%牛血清白蛋白溶液適量，是為了使陽性對照和陰性對照中含有一定的蛋白質(zhì)，與供試品（通常為蛋白質(zhì)）的酶切條件保持一致；如供試品為其他物質(zhì)，則應改用其他相應物質(zhì)。若預處理后的供試品溶液中的蛋白質(zhì)干擾本試驗，可用上述飽和苯酚溶液抽提法或其他適宜方法提取供試品DNA（陽性對照、陰性對照也應再次提取DNA，與供試品溶液平行）。無論采用何種方式抽取，Vero細胞DNA參考品至少應能達到10pg的檢測限。供試品為疫苗制品時，供試品和陽性對照均采用TE緩沖液進行稀釋。陰性對照為TE緩沖液。⑵點膜

用TE緩沖液浸潤雜交膜后，將預處理的供試品、陽性對照、陰性對照與空白對照置100℃水浴加熱10分鐘，迅速冰浴冷卻，以每分鐘8000轉(zhuǎn)離心5秒。用抽濾加樣器點樣于雜交膜（因有蛋白質(zhì)沉淀，故要視沉淀多少確定加樣量，以避免加入蛋白質(zhì)沉淀。所有供試品與陽性對照、陰性對照、空白對照加樣體積應一致，或按同樣比例加樣）。晾干后可采用紫外交聯(lián)法或置80℃真空干烤1小時以上。⑶雜交及顯色

按試劑盒使用說明書進行。結(jié)果判定

陽性對照應顯色，其顏色深度與DNA含量相對應，呈一定的顏色梯度；陰性對照、空白對照應不顯色，或顯色深度小于陽性DNA對照D3，試驗成立。將供試品與陽性對照進行比較，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中外源性DNA的含量。第二法

熒光染色法應用雙鏈DNA熒光染料與雙鏈DNA特異結(jié)合形成復合物，在波長480nm激發(fā)下產(chǎn)生超強熒光信號，可用熒光酶標儀在波長520nm處進行檢測，在一定的DNA濃度范圍內(nèi)以及在該熒光染料過量的情況下，熒光強度與DNA濃度成正比，根據(jù)供試品的熒光強度，計算供試品中的DNA殘留量。試劑

⑴1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH7.5）

用鹽酸調(diào)pH值至7.5。⑵0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH7.5）

用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.5。⑶TE緩沖液（pH7.5）

量取1mol/LTris溶液（pH7.5）1.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH7.5）0.2ml，加滅菌注射用水至100ml。⑷雙鏈DNA熒光染料

按試劑使用說明書配制。⑸DNA標準品

取DNA標準品適量溶于TE緩沖液中，制成50μg/mlDNA標準品，于-20℃保存。DNA標準品濃度根據(jù)下式計算：DNA濃度（μg/ml）=50×A260DNA標準品溶液的制備

用TE緩沖液將DNA標準品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的標準品溶液。測定法

精密量取DNA標準品溶液和供試品溶液各400μl于1.5ml離心管中，分別加入新配制的雙鏈DNA熒光染料400μl，混勻后，避光室溫放置5分鐘。取250μl上述反應液于96孔黑色酶標板中，并做3個復孔。用熒光酶標儀在激發(fā)波長480nm、發(fā)射波長520nm處測定熒光強度。以TE緩沖液測得的熒光強度為本底，測定和記錄各測定孔的熒光值。以標準品溶液的濃度對其相應的熒光強度作直線回歸，求得直線回歸方程（相關(guān)系數(shù)應不低于0.99），將供試品溶液的熒光強度代入直線回歸方程，求出供試品中DNA殘留量。注意事項

⑴DNA殘留量在1.25～80ng/ml范圍內(nèi)，本法線性較好，因此供試品DNA殘留量在該范圍內(nèi)可定量測定