質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)

實驗質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)分析實驗結(jié)果與討論實驗步驟實驗儀器與試劑實驗原理實驗?zāi)康姆肿由飳W(xué)實驗實驗?zāi)康?、掌握限制性內(nèi)切酶的工作原理，掌握酶切體系建立原則2、熟悉基因工程所用的限制酶的特點分子生物學(xué)實驗實驗原理

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。

由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶(簡稱限制酶)

。分子生物學(xué)實驗限制性內(nèi)切酶可分為三類限制性內(nèi)切酶酶分子識別位點切割位點限制作用是否需用ATPⅠ類三亞基雙功能酶二分非對稱至少在識別位點外1000

bpYesⅡ類(93%)內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起4-6

bp,大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)

在識別位點中或靠近識別位點無特異性NoⅢ類二亞基雙功能酶5-7

bp非對稱在識別位點下游24-26bpYes分子生物學(xué)實驗Ⅱ類限制性內(nèi)切酶分子克隆中常用的為II類限制酶，其識別位點長度為4、5或6個核苷酸的反向重復(fù)序列。限制酶的切割點因酶而異，有些產(chǎn)生帶平端的DNA片段，而另一些產(chǎn)生帶有粘性末端的DNA。如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端：

5'…GAATTC…3‘→5'…GAATTC…3'3'…CTTAAG…5'→3'…CTTAAG…5'分子生物學(xué)實驗HindIII:AAGCTTTTCGAAEcoRV:GATAGCCTATAGSmaI(30℃)CCCGGGGGGCCC分子生物學(xué)實驗限制酶的命名是根據(jù)細菌種類而定，一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株(品系)。

分子生物學(xué)實驗實驗儀器與試劑儀器：恒溫水浴鍋、離心管、移液器、槍頭、離心機、電泳設(shè)備等。試劑：

pUC19質(zhì)粒，EcoRI酶，酶切緩沖液，瓊脂糖，電泳緩沖液，EB，10x上樣緩沖液，無菌水等。分子生物學(xué)實驗實驗步驟1、在一個潔凈的0.5ml離心管中混勻下列反應(yīng)物反應(yīng)物體積（μl）ddH2O510×Buffer1.5質(zhì)粒DNA(1μg)8EcoRI(10U)0.5最終至15μl6000rpm/min稍離15s，將反應(yīng)物置于37℃水浴中溫浴1～2hr。分子生物學(xué)實驗實驗步驟2、6000rpm/min稍離15s，將反應(yīng)物置于37℃水浴中溫浴1～2hr。3、配膠：稱取1.4g瓊脂糖粉末，加入160ml1xTAE（配2瓶）

，反復(fù)煮沸三次后，待冷卻至約60℃后，倒膠，等待凝固（約30min），得到1%凝膠。4、酶切完成后，稍離，加入2μl10x上樣緩沖液混勻，然后上樣。另上樣20μlMarker，以及1份10μl質(zhì)粒（混合2μl10x上樣緩沖液）作為對照，120V電泳1hr。5、在紫外分析儀（凝膠成像系統(tǒng)）上觀察酶切的結(jié)果。分子生物學(xué)實驗電泳檢測示例分子生物學(xué)實驗注意事項

1、內(nèi)切酶要保持在冰浴上，避免長時間置于高溫中。2、加樣時槍頭直接垂直伸入EP管底部，避免碰到管壁，每加完一個樣要更換槍頭。同時要記住加樣的順序，以免漏加或錯加。3、加樣時酶最后加，并且加完酶后要用槍頭充分混勻。4、注意酶的用量、消化反應(yīng)溫度和時間。限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μgDNA加1單位酶,消化1～2hr。過少酶切不完全，過多會產(chǎn)生“星號活性”。分子生物學(xué)實驗星號活性：在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識別位點相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號活性。-----非特異性酶量過大：≧25U/μgDNA(較高的甘油濃度

)低鹽濃度（<25mM）高pH值（