清咽潤(rùn)喉檢驗(yàn)方法

清咽潤(rùn)喉檢驗(yàn)方法1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)1.1.1實(shí)驗(yàn)原理采用棉球作為異物植入動(dòng)物局部皮下，可引起與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽組織增生。比較給予受試樣品后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物與對(duì)照組動(dòng)物肉芽腫重量的差異，以確定受試樣品是否具有干預(yù)慢性炎癥（肉芽腫形成）的作用。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物推薦使用成年雄性大鼠，體重150－220克。每組8－12只。1.1.3劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組，三個(gè)劑量組中應(yīng)包括一個(gè)人體推薦量5倍的劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天。1.1.4儀器和材料手術(shù)器械、恒溫干燥箱、分析天平、注射器、乙醚（或異氟烷）、碘伏、脫脂棉、脫毛器1.1.5實(shí)驗(yàn)步驟1.1.5.1棉球的處理將脫脂棉制成約20~25mg緊致的小棉球，經(jīng)高壓滅菌后，置恒溫干燥箱60℃干燥3h，取出無(wú)菌條件下稱(chēng)重，干燥保存，備用。1.1.5.2肉芽腫的形成和測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束前8天，用脫毛器脫去大鼠兩側(cè)腹股溝處的毛，乙醚（或異氟烷）淺麻醉大鼠，碘伏消毒，在無(wú)菌條件下切開(kāi)大鼠兩側(cè)腹股溝皮膚，植入備用的棉球，縫合切口，繼續(xù)給予受試物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，給受試物1小時(shí)后，斷頸處死大鼠，在原縫合處剪開(kāi)皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，置于已稱(chēng)重潔凈平皿中，恒溫干燥箱60℃開(kāi)蓋干燥1小時(shí)后稱(chēng)重，計(jì)算肉芽腫凈量。肉芽腫凈量（mg）＝干燥后棉球肉芽腫重量－原棉球重量1.1.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，則計(jì)算F值。若F值<F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05結(jié)論為各組均數(shù)間差異有顯著性，需進(jìn)一步使用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)需進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)分布或方差齊的要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；若經(jīng)變量轉(zhuǎn)換仍不能達(dá)到正態(tài)分布或方差齊的目的，則改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，肉芽腫凈量明顯下降，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理差異有顯著性，可判定該受試樣品大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。1.1.7注意事項(xiàng)1.1.7.1所用棉球重量及表面積對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，故在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)盡可能保證所用棉球重量和表面積近似。1.1.7.2盡量使手術(shù)切口的大小一致，以減少差異。1.1.7.3植入棉球后，將切口縫合牢固，以免在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中棉球脫落，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.2大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)1.2.1實(shí)驗(yàn)原理一定量致炎劑注入大鼠后肢足趾皮下，可造成足趾腫脹。測(cè)定足趾容積，比較致炎劑作用前后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組足趾容積的變化，以確定受試樣品是否具有干預(yù)急性炎癥（足趾腫脹）的作用。1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1.2.3劑量分組及受試樣品給予時(shí)間1.2.4儀器和材料：致炎劑（推薦使用葡聚糖4萬(wàn)）、足趾容積測(cè)量?jī)x、無(wú)菌蒸餾水、0.25mL注射器。1.2.5實(shí)驗(yàn)步驟1.2.5.1致炎劑的配制用無(wú)菌蒸餾水配制濃度為1%的葡聚糖4萬(wàn)，備用。1.2.5.2足趾腫脹及測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天再給受試樣品一次，1小時(shí)后，用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量各組大鼠右后足趾的容積，作為0小時(shí)足趾容積。然后在大鼠右后足趾皮下注入1%葡聚糖4萬(wàn)0.1mL/只，分別于1、2、4、6小時(shí)測(cè)量大鼠足趾的容積，同一部位測(cè)量3次，取平均值。以不同時(shí)間所測(cè)足趾容積與致炎劑作用前的足趾容積之差為腫脹值，計(jì)算各個(gè)時(shí)間段的足趾腫脹率。腫脹率（%）=腫脹值／致炎前足趾容積×100%1.2.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，則計(jì)算F值。若F值<F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05結(jié)論為各組均數(shù)間差異有顯著性，需進(jìn)一步使用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)需進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)分布或方差齊的要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；若經(jīng)變量轉(zhuǎn)換仍不能達(dá)到正態(tài)分布或方差齊的目的，則改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，任一時(shí)間點(diǎn)刺激前后足趾容積腫脹率明顯減少，差異有顯著性，可判定該受試樣品大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。1.2.7注意事項(xiàng)1.2.7.1致炎劑注入的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，注入致炎劑時(shí)，應(yīng)將動(dòng)物后肢拉直，從右后足掌心向踝關(guān)節(jié)方向皮下注射致炎劑，并應(yīng)盡可能使動(dòng)物不動(dòng)。建議由專(zhuān)人負(fù)責(zé)致炎劑的注射，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。1.2.7.2測(cè)量足趾容積時(shí)，嚴(yán)格按儀器說(shuō)明操作。注意應(yīng)在鼠足某處用記號(hào)筆畫(huà)線作為測(cè)量標(biāo)線，將鼠足緩緩放入測(cè)量筒內(nèi)，當(dāng)水平面與鼠足上的測(cè)量標(biāo)線重疊時(shí)，踏動(dòng)腳踏開(kāi)關(guān)，記錄足趾容積，用吸水紙擦干鼠足上的水后，分別再進(jìn)行第2次和第3次測(cè)定。為避免測(cè)量誤差，測(cè)定人員應(yīng)事先進(jìn)行訓(xùn)練，掌握將鼠足放入測(cè)量筒內(nèi)的最佳方式，每個(gè)樣品的測(cè)量最好由專(zhuān)人進(jìn)行。1.2.7.3每次測(cè)定的部位要固定。1.3小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)1.3.1實(shí)驗(yàn)原理二甲苯為無(wú)色澄清液體，涂抹于小鼠耳廓后，由于其刺激作用，可引起鼠耳局部毛細(xì)血管充血，通透性增加，導(dǎo)致急性炎癥。比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組二甲苯作用后耳腫脹率的差異，以確定受試樣品是否具有干預(yù)急性炎癥（小鼠耳腫脹）的作用。1.3.2儀器和材料直徑9mm打孔器、致炎劑（二甲苯）、微量加樣器、分析天平1.3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物推薦使用近交系雄性小鼠，體重18－22克，每組10－15只。1.3.4劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組，三個(gè)劑量組中應(yīng)包括一個(gè)人體推薦量10倍的劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天。1.3.5實(shí)驗(yàn)步驟汲取二甲苯20μL，滴加在小鼠右耳外側(cè)面耳廓的中央，讓其自由擴(kuò)散，30分鐘后，將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9mm直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱(chēng)重，以?xún)啥亓恐顬槎[脹值，計(jì)算耳廓腫脹率。耳廓腫脹率（%）=耳廓腫脹值／對(duì)照耳片重量×100%1.3.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，則計(jì)算F值。若F值<F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05結(jié)論為各組均數(shù)間差異有顯著性，需進(jìn)一步使用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)需進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)分布或方差齊的要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；若經(jīng)變量轉(zhuǎn)換仍不能達(dá)到正態(tài)分布或方差齊的目的，則改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，耳廓腫脹率明顯減少，差異有顯著性，可判定該受試樣品小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。1.3.7注意事項(xiàng)1.3.7.1二甲苯具有對(duì)眼及上呼吸道有刺激作用，操作時(shí)，操作者應(yīng)注意自身的防護(hù)。1.3.7.2打下的耳片應(yīng)及時(shí)稱(chēng)重，以避免水分失去而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。1.4結(jié)果判定大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，同時(shí)大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)或小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果任意一項(xiàng)陽(yáng)性，可判定該受試樣品清咽潤(rùn)喉動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。2人體試食試驗(yàn)2.1受試者納入標(biāo)準(zhǔn)2.1.1體征：慢性咽炎人群，主觀癥狀有咽痛、咽癢、咽干、干咳、異物感、多言加重等。2.1.2咽部癥狀：咽部粘膜水腫、粘膜充血、咽后壁淋巴濾泡增生、分泌物附著。具有2.1.1及2.1.2中至少一項(xiàng)檢查所見(jiàn)的自愿受試者，即可納入觀察。2.2受試者排除標(biāo)準(zhǔn)2.2.1慢性咽炎急性發(fā)作期或急性咽炎、聲帶結(jié)節(jié)、感冒或吸煙因素所致者。2.2.2鼻咽、咽、喉、鼻、喉、食管、頸部及結(jié)核、轉(zhuǎn)移性肺癌病變所致者。2.2.3年齡在18歲以下或65歲以上者，妊娠和哺乳期婦女及對(duì)受試產(chǎn)品過(guò)敏者。2.2.4合并有心、腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)、支氣管和肺等嚴(yán)重疾病及精神病患者和有睡眠疾病的患者。2.2.5短期內(nèi)已服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到對(duì)結(jié)果的判斷者。2.2.6未按規(guī)定服用受試樣品或中途加服其它藥物，無(wú)法判斷功效或資料不全者。2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組要求采用自身和組間兩種對(duì)照設(shè)計(jì)。按受試者的咽部癥狀、體征隨機(jī)分為試食組和對(duì)照組，分組時(shí)盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如病程、年齡、性別等，進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.4受試樣品的劑量和使用方法試食組按推薦服用方法和服用量每日服用受試產(chǎn)品，對(duì)照組可服用安慰劑或采用空白對(duì)照，也可使用具有清咽潤(rùn)喉的保健食品作為對(duì)照。受試樣品給予時(shí)間15天~30天。試驗(yàn)期間受試者不改變生活、工作環(huán)境，不改變?cè)瓉?lái)生活、飲食習(xí)慣。2.5觀察指標(biāo)2.5.1安全性指標(biāo)2.5.1.1一般狀況（包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等）2.5.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.5.1.3肝、腎功能檢查2.5.1.4胸片、心電圖、腹部B超檢查（試驗(yàn)前檢查一次）2.5.2功效性指標(biāo)2.5.2.1癥狀觀察準(zhǔn)確記錄受試者試食前后的咽部主觀癥狀，主要咽部癥狀包括：咽痛、咽癢、咽干、干咳、異物感多言加重等，按癥狀輕重計(jì)算積分（1度—1分，2度—2分，3度—3分統(tǒng)計(jì)積分變化和癥狀改善率。2.5.2.2體征觀察咽部檢查：咽部粘膜充血、粘膜水腫、咽后壁淋巴濾泡增生、分泌物等體征。按檢查結(jié)果的輕、中、重分為I、II、III級(jí)，分別記錄試食前后體征變化，計(jì)算體征積分和改善率。觀察指標(biāo)功效判定：有效：癥狀減輕1度，咽部體征檢查結(jié)果減輕I級(jí)無(wú)效：癥狀、體征均無(wú)明顯改變2.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定積分變化可用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。凡自身對(duì)照資料可以采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)，后者需進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t’檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；但變異系數(shù)太大