凍融工藝在mRNA疫苗中應(yīng)用

我國(guó)mRNA疫苗的商業(yè)化進(jìn)程更慢，但已有多家企業(yè)入局。復(fù)星醫(yī)藥從BioNTech引進(jìn)的復(fù)必泰雖然國(guó)外已上市，但在國(guó)內(nèi)的上市進(jìn)程卻很緩慢。盡管如此，2021年復(fù)必泰在港澳臺(tái)地區(qū)的銷(xiāo)售額也超過(guò)了10億元。復(fù)星醫(yī)藥/BioNTech/Pfizer國(guó)外上市，國(guó)內(nèi)Ⅱ期臨床軍科院/艾博生物/沃森生物復(fù)星醫(yī)藥/BioNTech/Pfizer國(guó)外I/Ⅲ期，國(guó)內(nèi)I期臨床麗凡達(dá)生物(艾美疫苗)Ⅱ期臨床斯微生物Ⅱ期臨床云頂新耀(引進(jìn)自ProvidenceⅡ期臨床銳博生物/阿格納生物新冠mRNA疫苗l期臨床康希諾生物新冠mRNA疫苗獲批臨床石藥集團(tuán)獲批臨床應(yīng)用的重要挑戰(zhàn)。>除菌過(guò)濾>分裝凍存。雖然質(zhì)粒DNA生產(chǎn)所用工藝技術(shù)為行業(yè)現(xiàn)有技術(shù)，但當(dāng)前質(zhì)粒DNA生產(chǎn)成本仍然較高，這一方面是由于質(zhì)粒表達(dá)水平不高，只有特定長(zhǎng)度且高純度的質(zhì)粒原料，這使得下游純化路線較長(zhǎng)，收率只有30~40%。屬于無(wú)細(xì)胞體系的生物合成，因此相比于傳統(tǒng)微生物或細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)，具有工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、純化收率高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)。mRNA制備的主要工藝為：體外轉(zhuǎn)錄→轉(zhuǎn)錄后化學(xué)修飾→DNA酶處理→層析純化→超濾濃縮換液

原液除菌過(guò)濾>分裝凍存。mRNA的純度對(duì)于其安全性和有效性非常重要，因?yàn)殡s冷凍保存過(guò)程也可能導(dǎo)致新的雜質(zhì)產(chǎn)生。mRNA最終制劑的生產(chǎn)是當(dāng)前挑戰(zhàn)最大的環(huán)節(jié)，主要在于遞送系統(tǒng)的選擇、工藝控制、供應(yīng)鏈和專(zhuān)利限制等。mRNA原液的復(fù)融可能是被忽略的工藝環(huán)節(jié)，但復(fù)融過(guò)程中的重結(jié)晶可能是導(dǎo)致mRNA失活的重要原因之一。當(dāng)前在研的遞送載體包封的方法也很多，當(dāng)前的主流是采用微流控技術(shù)，通過(guò)高速的兩相混合形成包一。Utratitraton/Diafitraton為了給全球mRNA疫苗，尤其是新冠疫苗的生產(chǎn)和質(zhì)控、非臨床和臨床評(píng)價(jià)等提供信息和法規(guī)監(jiān)管指導(dǎo)，WHO于2021年10月正式通過(guò)了指南文件“Evaluationofthequality,safetyandefficacyofmessengerRNAvaccinesforthepreventionofinfectiousdiseases:regulatoryconside指南在6.8.2節(jié)指出“應(yīng)特別注意盡可能減少mRNA在包封過(guò)程中以及在生產(chǎn)條指南在第6.8.4.5節(jié)指出mRNA在LNP的包封率應(yīng)作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，因?yàn)槲窗獾膍RNA是不穩(wěn)定的。應(yīng)確認(rèn)最終產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)不會(huì)因?yàn)閮鋈谘h(huán)和稀釋而已上市COVID-19mRNA疫苗凍融案例分析具體現(xiàn)有mRNA疫苗的廠家都在哪些環(huán)節(jié)對(duì)凍融進(jìn)行了研究?以下分析內(nèi)容節(jié)選構(gòu)特性的詳細(xì)信息。此外，還提供了色譜圖、熱變性和凍融降解及其對(duì)蛋白表達(dá)評(píng)：該企業(yè)向監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供了凍融降解的數(shù)據(jù)，以及凍融對(duì)蛋白表達(dá)的影響數(shù)據(jù)?！駇RNA-loadedLNPintermediatemRNA-LNP復(fù)合物中間體提供了全面的開(kāi)發(fā)數(shù)據(jù)，描述了在開(kāi)發(fā)過(guò)程中所做的變更，包括規(guī)模放大、增加原液冷凍步驟、一些設(shè)備變更和脂質(zhì)摩爾比調(diào)整以匹配平臺(tái)工藝。評(píng)：該企業(yè)在生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中，增加了工藝放大過(guò)程，原液生產(chǎn)出來(lái)后，增加原液冷凍步驟，確保工藝的一致性。產(chǎn)品生產(chǎn)和工藝控制LNP生產(chǎn)工藝包括脂質(zhì)原料溶液(LSS)制備、納米沉淀混合、切向流過(guò)濾(TFF)、稀釋和冷凍保護(hù)劑添加、澄清、灌裝以及冷凍和儲(chǔ)存。評(píng)：在生產(chǎn)工藝中冷凍和存儲(chǔ)是分開(kāi)的，產(chǎn)品經(jīng)冷凍后存儲(chǔ)。工藝步驟必須關(guān)注批次間和批次內(nèi)的均一性，冷凍速率是關(guān)鍵參數(shù)之一。產(chǎn)品穩(wěn)定性使用開(kāi)發(fā)批次進(jìn)行了支持裝載mRNA的LNP中間體凍融循環(huán)的穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明，mRNA-1273LNP生物物理屬性(粒徑、多分散性、封裝)不會(huì)受到不同凍融過(guò)程(室溫或2~8°C)或5個(gè)凍融循環(huán)的影響。成品還進(jìn)行了支持成品凍融循環(huán)的穩(wěn)定性研究。凍融循環(huán)重復(fù)了多達(dá)五次。所有結(jié)果都在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，表明最終產(chǎn)品在反復(fù)凍融中相對(duì)穩(wěn)定，支持五次凍融循環(huán)。然而，批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品信息中顯示，成品不允許反復(fù)凍融。評(píng)：采用經(jīng)優(yōu)化的凍融工藝，中間體和成品可以耐受反復(fù)凍融，使產(chǎn)品質(zhì)量不受凍融循環(huán)的影響。臨床研究的設(shè)計(jì)和執(zhí)行RT-PCR分析經(jīng)過(guò)了可接受的驗(yàn)證，并提供了額外的驗(yàn)證研究，以評(píng)估臨床樣品在各種溫度和冷凍/復(fù)融循環(huán)中的穩(wěn)定性，以涵蓋運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件。評(píng)：在臨床階段做的凍融穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，涵蓋運(yùn)輸和存儲(chǔ)，也說(shuō)明凍融實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。為后期上市做準(zhǔn)備。SUS的凍融工藝方案和建議該企業(yè)采用了什么樣的凍融生產(chǎn)工藝方案?該公司在凍融工藝的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，和SUS進(jìn)行了緊密的合作。SUS根據(jù)此公司的特定工藝要求，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的凍融曲線和工藝方案。如何降低凍融過(guò)程對(duì)mRNA產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響?凍融過(guò)程從多個(gè)方面對(duì)mRNA分子形成壓力，工藝優(yōu)化的目標(biāo)是減少這些壓力的影響，包括：●盡可能減少冷凍濃縮帶來(lái)的濃度影響?！癖M量減少PH漂移給mRNA分子帶來(lái)聚集的發(fā)現(xiàn)●減少mRNA與冰液界面相互作用怎樣的冷凍工藝有利于mRNA產(chǎn)品質(zhì)量?經(jīng)驗(yàn)豐富的mRNA公司會(huì)選擇盡可能快地冷凍mRNA,某公司要求在5小時(shí)內(nèi)從液體冷凍到-60°C。以下是SUS公司為該mRNA公司提供的工藝摸索條件：SUS提供怎樣的凍融工藝解決方案?SUS公司專(zhuān)注于下游到灌裝之間的解決方案，產(chǎn)品涵蓋袋子保護(hù)殼RoSS、分裝設(shè)備RoSS.Fi11、凍融設(shè)備RoSS.pFTU、運(yùn)輸箱體RoSS.Ship等?！馬oSS保護(hù)殼的專(zhuān)利技術(shù)，完美保護(hù)了袋子的安全；·RoSS.Fi11快速精確分裝，超高靈活性和安全性；●RoSS.pFTU凍融設(shè)備大容量，超低溫，完美的凍融曲線；●RoSS.Ship超長(zhǎng)的保溫時(shí)間和超高安全的運(yùn)輸方式。現(xiàn)在RoSS.Fill分裝系統(tǒng)和凍融系統(tǒng)在全球已經(jīng)超過(guò)200多個(gè)用戶(hù)。研熠作為SUS在中國(guó)的合作伙伴，提供SUS產(chǎn)品的技術(shù)咨詢(xún)、產(chǎn)品