透明質(zhì)酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

透明質(zhì)酸發(fā)酵工藝優(yōu)化姓名：楊興旭學(xué)號：060516211一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過查閱資料并結(jié)合所學(xué)知識，了解并完成實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及過程。2、熟悉培養(yǎng)基制備、種子培養(yǎng)、發(fā)酵過程控制及菌種制備。3、掌握透明質(zhì)酸理化性質(zhì)、純化及含量測定方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理透明質(zhì)酸又名玻璃酸（Hyaluronicacid，簡稱HA）,是一種高分子量的線性大分子粘多糖，廣泛存在于生物體的結(jié)締組織及部分細(xì)菌中的高聚物。1934年Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離得到HA,1937年Kendell等從菌株中提取到HA。微生物發(fā)酵法，所需的原料易得，大大降低了生產(chǎn)成本。同時由于透明質(zhì)酸存在于菌體英膜上,易于與菌體分離,因而減少了提取成本。此后,人們對于HA的生理作用、化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、分布、制備工藝及其在醫(yī)療、化妝品和美容保健品方面的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛深入的研究。HA是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通過8-1,4和”-1,3糖苷鍵反復(fù)交替連接而成的一種高分子聚合物，由分子中的二種單糖（8-D-葡萄糖醛酸和N-乙?；?D-氨基葡萄糖）按等摩爾比交互連接而成。HA在空間上呈剛性的螺旋柱構(gòu)型，柱的內(nèi)側(cè)含有大量的羥基，因而產(chǎn)生強(qiáng)烈的親水性，HA分子間這種特定的構(gòu)型，使其具有很高的潤濕和粘度作用。目前，隨著微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA技術(shù)成為新的研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過對發(fā)酵條件溫度、碳源、氮源、接種量pH等條件進(jìn)行優(yōu)化，探究如何更好發(fā)酵生產(chǎn)HA,因?yàn)榘l(fā)酵液HA以游離狀態(tài)存在所以易于HA的分離純化。能夠產(chǎn)生HA的鏈球菌有A群和C群兩類，其中A群主要有化膿鏈球菌，因?yàn)槠渲虏⌒暂^高,一般不用作生產(chǎn)菌種；C群有獸疫鏈球菌、馬疫鏈球菌、類馬鏈球菌等均屬于非人體致病菌，所以可以用作HA的生產(chǎn)菌種，鏈球菌屬的大部分細(xì)菌都能夠像胞外分泌以HA為主要成分的莢膜。發(fā)酵法生產(chǎn)HA就是利用微生物在生長繁殖過程中向胞外分泌以HA為主要成分的莢膜，然后通過分離純化而制備得到HAHA白色、無固定形態(tài)、無臭無味，具有較強(qiáng)的吸濕形、溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。透明質(zhì)酸的合成途徑葡萄糖經(jīng)糖酵解(EMP)途徑形成6-磷酸果糖，然后在酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖胺，進(jìn)而合成UDP-GlcNAc；而UDP-GlcA是通過糖醛酸途徑合成的。菌體的HA分子鏈的延長是從內(nèi)源HA的非還原端進(jìn)行的，HA合成酶交替地將尿苷二磷酸-N-?；?氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸以每分鐘約100個糖單位的速度快速添加到HA分子鏈上，同時逐漸增長的HA鏈會穿過質(zhì)膜被送到胞外基質(zhì)中。HA的發(fā)酵生產(chǎn)主要工藝流程如下：斜面種子——搖瓶種子——接種——發(fā)酵培養(yǎng)——補(bǔ)料——放罐——發(fā)酵液（加乙醇粗提）——粗提液（加助濾劑、活性炭，調(diào)pH）——過濾（去除雜質(zhì)）——濾液（乙醇沉淀）——沉淀物（脫水干燥）——成品透明質(zhì)酸三、 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器發(fā)酵菌種（實(shí)驗(yàn)室保藏）、磷酸緩沖溶液：87.7mL0.2mol/L的KHPO與12.3mL0.2mol/L24的KHPO混合，配置成100MlpH6.0的溶液。24亞硝基胍溶液：需在通風(fēng)櫥中配制，準(zhǔn)確稱取40mgNTG,將其置于棕色瓶中，加1mL丙酮，溶解，隨后添加磷酸鹽緩沖液19mL,配制成2mg/mLNTG溶液番紅染液：準(zhǔn)確稱取番紅2.59，將其溶于95%乙醇中，定量100mL，取該配置好的溶液10mL與80mL蒸餾水混勻，即為番紅溶液。硼砂硫酸溶液：將4.77g四硼酸鈉溶于500mL濃硫酸中培養(yǎng)基配方：斜面培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基：培養(yǎng)基再生固體培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.2%，瓊脂2%，磷酸氫二鉀0.25%，硫酸鎂0.15%，pH=7.0種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1.5%，酵母粉0.6%，磷酸氫二鉀0.25%，硫酸鎂0.15%，谷氨酸0.1%，pH=7.0發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨0.6%，牛肉膏0.6%，酵母粉0.6%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.2%，，pH=6.9以上pH值用氫氧化鈉調(diào)節(jié)，121°C濕熱滅菌20min蒸汽發(fā)生器、發(fā)酵罐及控制系統(tǒng)、空氣壓縮機(jī)、紫外分光光度計(jì)，1、 透明質(zhì)酸含量測定：CTAB濁度法取1mL標(biāo)準(zhǔn)液或樣液于試管中，準(zhǔn)確加入2mLCTAB試液自加入時開始計(jì)時，輕輕振搖，然后靜置10min，于400nm波長下測定吸光度（A400。以HA濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測定的吸光度值，計(jì)算出HA濃度。2、 菌體量測定：在波長640nm測定發(fā)酵液吸光值。3、 斜面搖瓶培養(yǎng)：取活化于斜面的菌種兩環(huán)，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度37C，培養(yǎng)時間約14h。將培養(yǎng)好的種子接入裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，接種量為10%。4、 單因素實(shí)驗(yàn)測定：根據(jù)發(fā)酵條件溫度、碳源、氮源、接種量、pH等條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。5、根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素水平，以HA產(chǎn)量為檢查指標(biāo)，選用正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行研究，以確定最佳試驗(yàn)條件。6、根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素水平，以HA產(chǎn)量為指標(biāo),選用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行研究，以確定最佳搖瓶發(fā)酵條件。HA含量的測定：（Bitter-Muir氏法）原理：葡萄糖醛酸與沸騰的濃硫酸作用，經(jīng)過脫竣反應(yīng)形成戊搪，同時產(chǎn)生二氧化碳，二氧化碳與硼砂咔唑反應(yīng)生成紅色，在530nm處有最大吸收值，該吸收值與葡萄糖醛酸含量成線性關(guān)系。發(fā)酵液中殘余葡萄糖的測定：（3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS）法）原理：在堿性溶液中，葡萄糖被氧化為糖酸和其他產(chǎn)物，3，5-二硝基水楊酸則被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定的范圍內(nèi),葡萄糖的含量和棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸的顏色的深淺成正比關(guān)系,利用分光光度計(jì)在540nm波長處測定OD值,查對標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算,便可求出發(fā)酵液中葡萄糖的含量。五、實(shí)驗(yàn)步驟

HA的發(fā)酵生產(chǎn)主要工藝流程如下:斜面種子一搖瓶種子一接種一發(fā)酵培養(yǎng)一補(bǔ)料一放罐一發(fā)酵液（加乙醇粗提）f粗提液（加助濾劑、活性炭，調(diào)pH）f過濾（去除雜質(zhì)）一濾液（乙醇沉淀）一沉淀物（脫水干燥）一成品透明質(zhì)酸1、菌株活化取實(shí)驗(yàn)室-20°C保藏甘油管菌株,搖瓶進(jìn)行活化（30°C,200rpm,12h）,涂布于平板，30C倒置培養(yǎng)24h,4°C保存。種子培養(yǎng)方法在裝液量為100mL的錐形瓶（500mL）中接入已經(jīng)活化好的單菌落菌種，放在搖床中設(shè)置溫度30C、轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)至菌液ODnm為0.5~0.7，大約需要14h6002、搖瓶發(fā)酵2、搖瓶發(fā)酵按5%按5%（v/v）的接種量將種子液轉(zhuǎn)移接到裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種后的搖瓶置于30C下200rpm培養(yǎng)，9h后用4MNaOH或4MHPO調(diào)節(jié)pH為6.0左右。343、發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對HA的影響采用單因素方式篩選適合HA合成的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽的種類及添加量。若無特殊說明，每組單因素實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。（1）溫度對于菌體生長和發(fā)酵的影響在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上接種后選擇溫度條件分別為28C，30°C,32°C,34°C,36°C,38°C下，放在搖床中設(shè)置轉(zhuǎn)速200r/min進(jìn)行培養(yǎng)，考察溫度對于菌體生長及透明質(zhì)酸合成的影響，發(fā)酵結(jié)束取樣品測定細(xì)胞密度,及產(chǎn)物含量。（2）接種量對于菌體生長及發(fā)酵培的影響在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,用裝有50mL發(fā)酵液的250mL三角瓶在最適溫度下進(jìn)行分別接種量為5%,6%,7%,8%,9%,10%的條件下,放在搖床中設(shè)置轉(zhuǎn)速200r/min進(jìn)行培養(yǎng),考察接種量對于菌體生長及透明質(zhì)酸合成的影響,發(fā)酵結(jié)束取樣品測定細(xì)胞密度,及產(chǎn)物含量。3）pH對于菌體生長及發(fā)酵培的影響在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,用裝有50mL發(fā)酵液的250mL三角瓶在最適溫度下接種量為5%條件下調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0下,放在搖床中設(shè)置轉(zhuǎn)速200r/min進(jìn)行培養(yǎng)，考察pH對于菌體生長及透明質(zhì)酸合成的影響,發(fā)酵結(jié)束取樣品測定細(xì)胞密度,及產(chǎn)物含量。4）不同碳源對發(fā)酵的影響（葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和木糖）將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖依次以相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖、果糖、麥芽糖、半乳糖、木糖替換,其余組分及添加量均不變,在37C、200r/min條件下發(fā)酵24h。研究碳源類別對HA合成量的影響。持其他組分比例不變,初始葡萄糖添加量分別為20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120g/L，設(shè)置溫度為37°C、搖床轉(zhuǎn)速為200r/min,培養(yǎng)時間為24h,發(fā)酵結(jié)束后測定HA的濃度，選擇碳源為2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨1.0%，KHPO0.2%，NaCl240.2%,MgSO?7HO0.03%,pH=7.2,裝量為10%；37C,100rpm培42養(yǎng)18h。5）不同氮源對發(fā)酵的影響氮源及其添加量對透明質(zhì)酸合成的影響分別以牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米漿、黃豆粉和硫酸銨為氮源,分析氮源對菌體合成HA的影響,當(dāng)?shù)礊?.0%,葡萄糖2.0%,KHPO0.2%,NaCl0.2%,MgSO?7HO2 4 4 20.03%,pH=7.2，裝量為10%,37C,100rpm培養(yǎng)18h。4、指標(biāo)測定（1）HA含量的測定：（Bitter-Muir氏法）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取100pg/mLHA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置于20mL具塞試管中，各加水至1.0mL,混勻,冰浴中冷卻,并在不斷攪拌下緩緩加入硼砂硫酸溶液5.0mL,密塞,沸水浴中加熱10分鐘,放冷。精密加入咔唑溶液0.2mL,搖勻,沸水浴中加熱15分鐘,放冷。照紫外-可見分光光度法（中國藥典2005年版二部附錄WA）,在530nm波長處測定吸光度，以葡萄糖醛酸的Mg數(shù)（mg）對相應(yīng)的吸光度計(jì)算回歸方程（回歸相關(guān)系數(shù)〉0.990）。（2）發(fā)酵液中HA待測樣品液的制備：將10mL的發(fā)酵液加入其2倍體積的酒精中，室溫下攪拌后靜置30min,離心，棄上清液，再加入1同體積蒸餾水，溶解，即得供試樣品液。在實(shí)際測定時，需要根據(jù)發(fā)酵液中HA含量稀釋一定倍數(shù)，使分光光度計(jì)的讀數(shù)在0.2-0.8之間。測定：精密量取供試溶液1.0ml置于具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備自“冰水浴中冷卻”起依照該法進(jìn)行操作，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖醛酸質(zhì)量（mg）。計(jì)算：根據(jù)理論計(jì)算，HA分子中葡萄糖醛酸的含量為46.32%，故葡萄糖醛酸質(zhì)量實(shí)驗(yàn)材料：3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS）：將6.3g3，5-二硝基水楊酸和262mL加ol/L的NaOH溶液，加到500mL含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，攪拌完全溶解，再加5g重蒸酚和5g亞硫酸氫鈉于其中，攪拌溶解，冷卻后定容到1000mL,溶液為黃色，貯于棕色瓶中。lmg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)105°C烘至恒重的分析純無水葡萄糖1g，置于干燥小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后在容量瓶定容至1000mL?；靹?，4C冰箱中保存?zhèn)溆?。測定方法：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支25X250mm試管編號，按表3.1分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)通過前面單因素試驗(yàn)，分別考查了各單因素對HA產(chǎn)量的影響，在此基礎(chǔ)上，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對產(chǎn)HA發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以獲得適宜培養(yǎng)基組分，從而提高HA產(chǎn)量。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酵母膏、蛋白胨、葡萄糖和MgSO?7H0四個因素，通過組試42驗(yàn)對自變量和因變量進(jìn)行分析DNS法實(shí)驗(yàn)方法試管編號試劑012345葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/mL—0.10.20.30.40.5相當(dāng)于匍萄糖量/mg0.10.20.30.40.50.1蒸餾水/mL0.50.40.30.20.1—DNS試劑/mL0.50.50.50.50.50.5沸水浴5min，冷水冷卻至室溫蒸餾水/mL8.08.08.08.08.08.0A540將上述各管混勻，沸水浴5min,冷卻至室溫，于分光光度計(jì)波長540nm處進(jìn)行比色。用0號管進(jìn)行調(diào)零點(diǎn)，測出1-5號管吸光度（A）。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中還原糖的測定取發(fā)酵液適當(dāng)濃度稀釋液（測定OD值最好在0.2-0.8之間）0.5mL于25X250mm試管中，加入0.5mLDNS試劑，同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，測吸光值。根據(jù)測得的0D值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖量，并按下式計(jì)算出發(fā)酵液中葡萄糖的含量。計(jì)算葡萄糖含量——一A 由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得葡萄糖的質(zhì)量，mg；0.5——