奶及奶制品中α-乳白蛋白的測(cè)定 高效液相色譜法

1奶及奶制品中α-乳白蛋白的測(cè)定高效液相色譜法本文件描述了奶及奶制品中α-乳白蛋白的高效液相色譜測(cè)定方法。本文件適用于生乳和巴氏殺菌乳。本文件的定量限為25.0mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理試樣溶液調(diào)節(jié)pH至4.6，使酪蛋白和變性的乳清蛋白沉淀，而未變性的α-乳白蛋白仍保留在溶液中，對(duì)紫外光有吸收作用，在液相色譜儀經(jīng)反相蛋白質(zhì)分離柱分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。5試劑或材料除非另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純和符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1乙酸。5.2三氟乙酸溶液：量取1mL三氟乙酸（色譜純），用水定容至1L，混勻。5.3三氟乙酸乙腈溶液：量取1mL三氟乙酸（色譜純），用乙腈（色譜純）定容至1L，混勻。5.4α-乳白蛋白對(duì)照品：CAS：9051-29-0，純度≥85.0%。5.5α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10mg/mL）：將α-乳白蛋白對(duì)照品按對(duì)照品證書(shū)提供的純度換算后稱量（精確到0.01g），用水定容至10mL。冷凍保存，有效期3個(gè)月。25.6α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（200mg/L）：準(zhǔn)確移取α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.5）200μL，用水定容至10mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。5.7α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.6），用水稀釋定容，配制成α-乳白蛋白濃度分別為0mg/L、40.0mg/L、80.0mg/L、120.0mg/L、160.0mg/L和200.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.8微孔濾膜：水系，0.22μm。6儀器設(shè)備6.1高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。6.2天平：感量0.01g、0.01mg。6.3容量瓶：10mL、25mL。6.4旋渦混合器。6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。6.6pH計(jì)：精度為0.01。7樣品取有代表性樣品約200g，混勻，裝入潔凈容器作為試樣，密封并做好標(biāo)識(shí)，冷藏保存。8試驗(yàn)步驟8.1樣品提取稱取試樣5g（精確到0.01g），加適量水混勻，加入乙酸調(diào)節(jié)pH為4.60±0.05，加水定容至25.0mL，混勻靜置1h。離心15min。吸取上清液，過(guò)微孔濾膜后待測(cè)。8.2測(cè)定步驟8.2.1液相色譜參考條件——色譜柱：XbridgeProteinBEHC4柱（柱長(zhǎng)250mm，柱內(nèi)徑4.6mm，填料粒徑3.5μm或相當(dāng)者?！鲃?dòng)相：A：三氟乙酸溶液（5.2B：三氟乙酸乙腈溶液（5.3）?！獧z測(cè)波長(zhǎng)：210nm。——梯度洗脫條件見(jiàn)表1。3——流速：1.5mL/min。——柱溫：60oC?！M(jìn)樣量：30μL。表1流動(dòng)相梯度洗脫條件時(shí)間/（min）A/（%）B/（%）09556.56238623822594122.5406027.5406028955359558.2.2測(cè)定取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.7）和試樣溶液（7）上機(jī)測(cè)定。以α-乳白蛋白的峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖參見(jiàn)附錄A。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中α-乳白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X計(jì)，數(shù)值以毫克每千克(mg/kg)表示，按下列公式計(jì)算：f式中：c——被測(cè)組分曲線計(jì)算濃度，單位為毫克每升(mg/L)；V——樣液最終定容體積，單位為毫升(mL)；m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；f——稀釋倍數(shù)51000——換算系數(shù)計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后一位。10精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于算術(shù)平均值的10%。附錄A（資料性）α-乳白蛋白液相色譜圖