生物化學(xué)電子教程

§2.7酶的作用機(jī)理及實(shí)例1.底物和酶的接近(proximity)與定向(orientation)在化學(xué)反響中，反響速度與反響物的濃度成正比，假設(shè)在酶促反響系統(tǒng)中的催化場(chǎng)所—酶的活性中心，添加底物濃度，反響速度也會(huì)隨之添加。酶促反響加速的緣由之一，就是使底物分子集中于酶的活性中心，大大提高這個(gè)區(qū)域底物的有效濃度，從而加速酶促反響速度。曾測(cè)過某酶促反響中，溶液中的底物濃度為0.001mol/L,而在活性中心的底物濃度竟到達(dá)10mol/L，比溶液中高出一萬倍！因此在酶活性中心區(qū)域的高底物濃度決議了高的反響速度。一.決議酶高效率催化的機(jī)制僅僅是接近還不夠，還需求酶和底物的反響基團(tuán)在反響中彼此相互嚴(yán)厲地定向，即酶活性中心的催化基團(tuán)(氨基酸殘基上的基團(tuán))定向于底物的反響基團(tuán)。只需既接近又定向，底物分子才干迅速的構(gòu)成過渡態(tài)，加速反響的進(jìn)展。接近與定向A.酶的催化基團(tuán)和底物的反響基團(tuán)既不接近，也不定向。B.兩個(gè)基團(tuán)接近，但不定向，不利于反響進(jìn)展。C.兩個(gè)基團(tuán)既接近，又定向，有利于反響進(jìn)展。2.底物變形(distortion)與電子張力(electronstrain)酶與底物結(jié)合后，底物發(fā)生變形，底物由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，降低了活化能，使酶促反響加速。酶與底物結(jié)合后，底物發(fā)生形變。酶與底物結(jié)合后，酶分子中的某些基團(tuán)或離子可以使底物敏感鍵中的某些基團(tuán)的電子云密度添加或降低，從而產(chǎn)生電子張力，使敏感鍵的一端更加敏感，更易于發(fā)生反響。3.共價(jià)催化(covalentcatalysis)共價(jià)催化的普通方式是酶活性中心上的親核基團(tuán)對(duì)底物的親電子基團(tuán)進(jìn)展攻擊，二者構(gòu)成共價(jià)鍵，這個(gè)共價(jià)中間物很容易變成過渡態(tài)，反響的活化能大大降低，反響速度加快。酶分子上的親核基團(tuán)有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，這些富含電子的基團(tuán)(有孤對(duì)電子)，攻擊底物分子中電子云密度較小的親電子基團(tuán)，并供出電子，二者構(gòu)成共價(jià)鍵，酶和底物構(gòu)成一個(gè)不穩(wěn)定的中間物，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。蛋白質(zhì)中三種主要的親核基團(tuán)4.酸堿催化(acid-basecatalysis)共價(jià)催化也可以是酶的親電基團(tuán)對(duì)底物的親核基團(tuán)進(jìn)展攻擊，酶分子上帶正電的基團(tuán)有H+、Mg2+、Fe3+—NH3+等，它們攻擊底物分子上帶負(fù)電的親核基團(tuán)，與底物構(gòu)成共價(jià)鍵,進(jìn)展催化。酶活性中心的一些基團(tuán)作為質(zhì)子的供體或質(zhì)子的受體對(duì)底物進(jìn)展廣義的酸堿催化。組氨酸的咪唑基是酶催化反響中的最有效、最活潑的催化功能基團(tuán)。咪唑基的pk=6.0,在生理pH條件下，有一半以酸性方式存在，另一半以堿性方式存在，因此既可以作質(zhì)子的供體又可以作質(zhì)子的受體，在酶促反響中發(fā)揚(yáng)作用。廣義酸基團(tuán)〔質(zhì)子供體〕廣義堿基團(tuán)〔質(zhì)子受體〕COOHCOO-NH3+NH2¨OHO-SHS-CCHNHN+HCHCCHNHN∶CH蛋白質(zhì)中作為廣義酸堿催化的功能基團(tuán)5.微環(huán)境效應(yīng)酶的活性中心周圍的環(huán)境是一個(gè)非極性環(huán)境，即低介電環(huán)境，在低的介電環(huán)境中排斥水分子，酶的催化基團(tuán)和底物分子的敏感鍵之間有很大的反響力，有助于加速酶促反響。假設(shè)酶的活性中心周圍是一個(gè)高介電環(huán)境中，活性中心就會(huì)有水分子存在，水分子對(duì)帶電離子有屏蔽作用，減弱帶電離子之間的靜電作用，不利于酶促反響的進(jìn)展。例如：酶活性中心的羧基與水構(gòu)成氫鍵，導(dǎo)致酶活性中心羧基外表有一層水化層，水分子的屏蔽作用，大大減弱了酶分子與底物離子間的靜電相互引力，不利于酶促反響。二.溶菌酶〔lysozyme)溶菌酶存在于雞蛋清和動(dòng)物的眼淚中，其生物學(xué)功能是催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖水解，從而溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁。溶菌酶是第一個(gè)用X-射線法闡明其全部構(gòu)造和功能的酶。是1922年倫敦細(xì)菌學(xué)家弗萊明(Fleming)初次發(fā)現(xiàn)的。1.底物、溶菌酶及酶和底物復(fù)合物的構(gòu)造溶菌酶的底物溶菌酶經(jīng)過水解某些細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖組份來溶解細(xì)胞壁，細(xì)胞壁的多糖由兩種糖組成:N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)溶菌酶的最適小分子底物NAG和NAM交替陳列構(gòu)成多聚物，它們之間經(jīng)過β-1,4糖苷鍵相連。溶菌酶的最適小分子底物為NAG-NAM交替構(gòu)成的六糖。6個(gè)糖環(huán)分別用A、B、C、D、E、F表示。溶菌酶水解D糖環(huán)和E糖環(huán)之間的糖苷鍵。溶菌酶的構(gòu)造

溶菌酶由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是一個(gè)單鏈蛋白，分子內(nèi)含有四對(duì)二硫鍵?；钚灾行牡陌被釟埢荊lu35和Asp52。雞蛋蛋清溶菌酶的氨基酸序列溶菌酶和底物結(jié)合的空間構(gòu)象從外表構(gòu)象看，酶的構(gòu)造不很嚴(yán)密，大多數(shù)極性氨基酸殘基分布在分子的外表，非極性氨基酸殘基分布在分子的內(nèi)部。整個(gè)酶分子中有一狹長(zhǎng)的凹穴。最適底物正好與酶分子的凹穴相結(jié)合，凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸殘基。溶菌酶----底物復(fù)合物2.催化作用機(jī)理溶菌酶底物與酶活性中心的關(guān)系溶菌酶活性中心上的Asp52氧原子間隔底物敏感鍵(C-O鍵)中碳原子〔D糖環(huán)氧原子〕只需0.3nm，活性中心上另一個(gè)氨基酸Glu35的羧基間隔底物敏感鍵(C-O鍵)中氧原子也只需0.3nm，溶菌酶的活性中心的氨基酸殘基與底物敏感鍵既接近又定向。底物D糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生變化溶菌酶底物D糖環(huán)變形模型圖椅式：C5、C1、C2和O不在同一平面C5向前挪動(dòng)，O原子向后挪動(dòng)半椅式：C5、C1、C2和O在同一平面上酶與底物結(jié)合后，D糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生變形，從正常的能量較低的椅式構(gòu)象變?yōu)槟芰枯^高的半椅式構(gòu)象。酸堿催化酶活性中心的Glu35處于非極性區(qū)，其羧基呈不解離形狀，而Asp52處于極性區(qū)，羧基呈解離形狀。Glu35COC1C4HOEOH(NAG)NAGOOHOCO-Asp

52Asp

52-COOONAGDHOEOHC4C1OCGlu

35-HOH-+H2O+H非極性區(qū)極性區(qū)(NAG)O33Glu35的羧基起廣義酸堿催化，向底物D糖環(huán)和E糖環(huán)之間的糖苷鍵上的氧原子提供一個(gè)質(zhì)子，氧原子與D糖環(huán)C1的糖苷鍵斷開，D糖環(huán)的C1帶上正電荷成為正碳離子。Asp52上的-COO-起著協(xié)調(diào)糖苷鍵斷裂和穩(wěn)定正碳離子的作用。DGlu35COOHOC1HOHD(NAG)3OCO-Asp

52最后，來自環(huán)境中的水分子上的H+與Glu35的-COO-結(jié)合，水分子上的HO-與正碳離子結(jié)合，至此，一次反響完成，細(xì)胞壁翻開一個(gè)缺口。經(jīng)多次反復(fù)作用，細(xì)菌的細(xì)胞壁溶解。3.溶菌酶催化特點(diǎn)小結(jié)接近與定向底物形變酸堿催化〔二〕胰凝乳蛋白酶〔chymotrypsin)胰凝乳蛋白酶是由241個(gè)氨基酸組成，分子量為25000，分子呈橢圓狀，含α-螺旋較少?；钚圆课挥蒘er195、His57、Asp102三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，這三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成催化三聯(lián)體。催化三聯(lián)體：催化機(jī)理：酶活性中心的三個(gè)氨基酸底物His57作為質(zhì)子的受體從Ser195汲取一個(gè)質(zhì)子，構(gòu)成共價(jià)鍵，使Ser195-O-成為很強(qiáng)的親核試劑，攻擊底物羰基碳原子，二者構(gòu)成共價(jià)鍵。電子云向底物羰基氧原子轉(zhuǎn)移第一步第二步底物-NH上的電子云向酶分子的His57-N+H轉(zhuǎn)移，His57作為酸向底物提供質(zhì)子。底物的C-N鍵斷裂第三步底物C-N鍵氮端產(chǎn)物釋放第四步第五步水分子的-OH親核攻擊底物羰基碳原子,構(gòu)成共價(jià)鍵。His57作為質(zhì)子的受體從水分子上接受質(zhì)子。第六步底物C-O-的電子云向His57-N+H轉(zhuǎn)移,Ser195的氧與底物的碳之間的共價(jià)鍵斷開。Ser195作為質(zhì)子的受體從His57接受質(zhì)子，酶恢復(fù)原狀。第七步第八步胰凝乳蛋白酶催化機(jī)制的特點(diǎn)：廣義的酸堿催化共價(jià)催化絲氨酸蛋白酶〔serineproteases〕絲氨酸蛋白酶是一類最有特征的酶家族，它包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、枯草桿菌蛋白酶等。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶為消化酶，在胰腺中合成，以非活性的酶原方式分泌到消化道，在消化道中轉(zhuǎn)化成有活性的酶。這三種酶在一級(jí)構(gòu)造上有40%的氨基酸順序是一樣的，三維構(gòu)造也很類似，都有Ser195、His57、Asp102三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的催化三聯(lián)體，它們的催化作用機(jī)理也類似，但它們的專注性是完全不同的。這三種酶的活性部位位于分子外表的凹陷區(qū)域，這個(gè)凹陷構(gòu)造區(qū)域稱為口袋。由于三種蛋白酶的口袋的差別呵斥它們的專注性不同。胰凝乳蛋白酶的口袋底部有一個(gè)小的Ser，口袋上方有兩個(gè)小的Gly殘基，有利于較大的芳香族氨基酸側(cè)鏈進(jìn)入，因此胰凝乳蛋白酶催化芳香族氨基酸構(gòu)成的肽鍵。胰蛋白酶口袋底部有一個(gè)帶負(fù)電荷的Asp，有利于結(jié)合帶正電荷的Arg、Lys殘基，決議了胰蛋白酶可以催化精氨酸和賴氨酸羧基構(gòu)成的肽鍵。彈性蛋白酶有一個(gè)淺的口袋，口袋上方有大的Thr和Val殘基，只允許小分子的氨基酸像甘氨酸、丙氨酸進(jìn)入，因此彈性蛋白酶可催化甘氨酸和丙氨酸羧基構(gòu)成的肽鍵。§2.8酶原激活有些酶在體內(nèi)合成出來即可自發(fā)的折疊成一定的三級(jí)構(gòu)造，酶就立刻表現(xiàn)出酶活性，如溶菌酶。有些酶在體內(nèi)合成出來的只是它的無活性的前體，經(jīng)過蛋白酶的催化作用，構(gòu)象發(fā)生變化，才干變成有活性的酶。該活化過程，是生物體內(nèi)的一種調(diào)控機(jī)制。這種調(diào)控機(jī)制的特點(diǎn)：由無活性的酶原轉(zhuǎn)變成有活性的酶是不可逆轉(zhuǎn)的。一.胰蛋白酶原的激活二.胰凝乳蛋白酶原的激活三、幾種蛋白酶的激活及它們之間的相互作用彈性蛋白酶胰蛋白酶原六肽＋胰蛋白酶本身催化腸激酶羧肽酶原羧肽酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原§2.7寡聚酶、同功酶、誘導(dǎo)酶、固定化酶一、寡聚酶寡聚酶是由兩個(gè)或多個(gè)亞基組成的酶。二、同功酶同功酶是指能催化同一化學(xué)反響，但其酶蛋白本身的分子構(gòu)造組成都有所不同的一組酶，它們的Km和Vm各不一樣。如：哺乳動(dòng)物中有五中乳酸脫氫酶，它們催化同一反響，分子量相近，但氨基酸組成及順序不同，可用電泳法得到。三、誘導(dǎo)酶根據(jù)誘導(dǎo)酶合成與代謝物的關(guān)系。人們把酶相對(duì)地域分為構(gòu)造酶和誘導(dǎo)酶。構(gòu)造酶是指細(xì)胞內(nèi)天然存在的酶，它的含量穩(wěn)定，受外界的影響小。誘導(dǎo)酶是指當(dāng)細(xì)胞中參與特定誘導(dǎo)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶。它的含量在誘導(dǎo)物存在下顯著增高。這種誘導(dǎo)物往往是該酶底物的類似物或底物本身。誘導(dǎo)酶或許是細(xì)胞中本身就存在，但含量低，當(dāng)參與誘導(dǎo)物后顯著增高；或許是細(xì)胞中不存在這種酶，當(dāng)參與誘導(dǎo)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生。四、固定化