礬根組培苗工廠化培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

4DBXXXXXXX—XXXX礬根組培苗工廠化培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了礬根（HeucheramicranthaDouglasexLindl.）組織培養(yǎng)育苗過程中材料的選擇、消毒滅菌、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、組培苗的移栽和技術(shù)檔案的建立等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于礬根在省內(nèi)的工廠化組織培養(yǎng)育苗生產(chǎn)作業(yè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。LY/T1770桉樹無性系組培快繁技術(shù)規(guī)程LY/T1882林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程LY/T2041黃藤和單葉省藤組培快繁技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T2253菠蘿組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程DB31/T349非洲菊組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程DB31/T1806藍(lán)莓組培育苗技術(shù)規(guī)程DB21/T2433樹莓組培育苗技術(shù)規(guī)程3定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1礬根（HeucheramicranthaDouglasexLindl.）虎耳草科、礬根屬多年生耐寒草本花卉。3.2外植體根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官（如根、莖、葉、莖尖、花、果實(shí)等）組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細(xì)胞、胚乳等）或細(xì)胞（如大孢子、小孢子、體細(xì)胞等）以及原生質(zhì)體，稱為外植體。3.3組培苗在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等人工條件下，誘導(dǎo)出愈傷組織，不定芽、不定根，最后發(fā)育成完整的植株，稱為組培苗。5DBXXXXXXX—XXXX3.4初代培養(yǎng)又稱誘導(dǎo)培養(yǎng)，外植體無菌接種后，置于培養(yǎng)室的弱光條件下進(jìn)行培養(yǎng)，首次獲得無菌材料，然后逐漸促進(jìn)材料的分化和生長，這是試管苗的第一代，稱初代培養(yǎng)。3.5繼代培養(yǎng)又稱分化培養(yǎng)，初代培養(yǎng)以后通過不斷調(diào)試培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)接試管苗，使試管苗數(shù)量很快擴(kuò)大，這種不斷轉(zhuǎn)苗增殖的過程稱為繼代培養(yǎng)。3.6生根培養(yǎng)在培養(yǎng)基上，利用從莖表皮細(xì)胞分裂形成凸起的根原基，進(jìn)一步從表皮培養(yǎng)形成根的過程。4組培室的構(gòu)成及基礎(chǔ)設(shè)備4.1洗瓶室用于玻璃器皿和實(shí)驗(yàn)用具的洗滌、干燥和貯存；培養(yǎng)材料的預(yù)處理與清洗；組培苗的出瓶、清洗和整理等。要求房間寬敞明亮，方便多人同時(shí)工作，有電源、水源，上下水通暢；地面耐濕、防滑、排水良好，便于清潔。設(shè)備及用具：工作臺(tái)、烘箱、晾干架、周轉(zhuǎn)筐、各種規(guī)格的毛刷、藥品柜等。4.2培養(yǎng)基配置室用于培養(yǎng)基的配置、植物材料的預(yù)處理。要求房間寬敞明亮、通風(fēng)干燥，方便多人同時(shí)工作，有電源、水源，上下水通暢。設(shè)備及用具：電子分析天平、托盤水平、電子天平、磁力攪拌器、蒸餾水器、酸度計(jì)、恒溫水浴振蕩器、微波爐、冰箱、展示柜、移液管、培養(yǎng)瓶、試劑瓶、燒杯、量筒、容量瓶、培養(yǎng)皿、玻璃棒、記號(hào)筆、封口膜、瓶蓋、周裝筐、紗布、小推車等。4.3滅菌室用于培養(yǎng)基、器皿、工具和其他物品的消毒滅菌。要求安全、通風(fēng)、明亮，墻面和地面防潮、耐高溫。水源、電源加熱；上下水通暢。設(shè)備及用具：壓力滅菌鍋、周轉(zhuǎn)筐、換氣扇、小推車等。4.4接種室進(jìn)行植物材料的接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移等無菌操作，即無菌操作室。要求空間宜小不宜大，密閉、干爽安靜、清潔明亮、不易積塵。門窗封閉性好、吊裝紫外光燈，保持環(huán)境無菌或低密度有菌狀態(tài)；安置空調(diào)機(jī)；人流與物流分開。設(shè)備及用具：超凈工作臺(tái)、空調(diào)機(jī)、接種器械滅菌器、紫外光燈、酒精燈、廣口瓶、三角瓶、接種工具、手持噴霧器、工作臺(tái)、污物桶等。4.5培養(yǎng)室用于培養(yǎng)離體材料。要求面積不宜過大，10-20m2，培養(yǎng)室外有緩沖間或走廊；能夠控制光照和溫度；保持整潔，防止微生物污染；可通風(fēng)、降濕、散熱；專線供電和配電設(shè)備。6DBXXXXXXX—XXXX設(shè)備及用具：空調(diào)、排風(fēng)扇、培養(yǎng)箱、除濕機(jī)、時(shí)控器、干濕溫度計(jì)、培養(yǎng)架、日光燈、工作臺(tái)、配電箱等。5材料的選擇5.1選擇的部位應(yīng)選擇礬根的莖尖。5.2取材季節(jié)的選擇在春季芽開始萌發(fā)或正萌發(fā)生長時(shí)取材。5.3器官發(fā)育年齡的選擇以當(dāng)年嫩芽做材料，分生能力強(qiáng)，形態(tài)建成快。5.4取材的大小莖尖長0.5cm-1.0cm，6消毒滅菌6.1外植體消毒滅菌用流水沖洗2h以上，拿到超凈工作臺(tái)上，用75%酒精處理30s-40s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞處理3min-4min，無菌水沖洗5次。6.2培養(yǎng)基高壓滅菌用高壓滅菌鍋在壓力1.1MPa，溫度為121℃下，滅菌20min。6.3接種器具滅菌剪子、鑷子、500ml燒杯（處理外植體使用）用牛皮紙包裝，做到無漏洞，捆綁好，用高壓滅菌鍋在壓力1.1MPa，溫度為121℃下，滅菌20min。7初代培養(yǎng)7.1培養(yǎng)基配制初代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+GA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4.8g/L。7.2培養(yǎng)環(huán)境條件在無菌環(huán)境下，培養(yǎng)室溫度23℃-25℃,濕度20%-30%，光照強(qiáng)度2200lx-2500lx，整齊擺放在培養(yǎng)架（五層，每層間隔45cm，透光）上。7.3培養(yǎng)方法在植物生長季節(jié)選取0.5cm-1.0cm長的礬根莖尖，先用75%酒精消毒30s-40s，再用0.1%升汞溶液消毒處理3min-4min，然后用無菌水洗滌5次，最后在無菌超凈工作臺(tái)上將其接種到初代培養(yǎng)基中。7DBXXXXXXX—XXXX8繼代培養(yǎng)8.1培養(yǎng)基配制分化培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：MS+BA0.5mg/L+GA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4.8g/L8.2培養(yǎng)環(huán)境條件在無菌的環(huán)境下，培養(yǎng)室溫度23℃-25℃,濕度20%-30%，光照強(qiáng)度2200lx-2500lx，整齊擺放在培養(yǎng)架（五層，每層間隔45cm，透光）上。8.3培養(yǎng)方法外植體長滿培養(yǎng)瓶，就需轉(zhuǎn)入到新的增殖培養(yǎng)基中，在無菌超凈工作臺(tái)上，用接種剪子、鑷子剪取芽叢接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種6叢，長滿瓶后重復(fù)操作，這樣一代代增殖后，就形成了二代礬根組培苗的無性繁殖體系。8.4增殖速率的計(jì)算1年內(nèi)能繁殖試管苗的數(shù)量，可用下式計(jì)算：y=mxn式中：y為年繁殖苗數(shù)；m為無菌母株苗數(shù)；x為每個(gè)培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)；n為全年可增殖的周期次數(shù)。實(shí)際計(jì)算中，從接種開始，由1個(gè)芽經(jīng)過1年繁殖后，應(yīng)記錄轉(zhuǎn)接次數(shù)，統(tǒng)計(jì)實(shí)際得到的苗數(shù)，然后可以計(jì)算出實(shí)際繁殖周期和每個(gè)周期試管苗增殖的倍數(shù)。實(shí)際繁殖數(shù)往往低于理論計(jì)算數(shù)。9生根培養(yǎng)9.1培養(yǎng)基配制生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：1/2MS+BA0.3mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂4.8g/L9.2培養(yǎng)環(huán)境條件培養(yǎng)室溫度18℃-25℃,濕度20%-30%，光照強(qiáng)度2200lx-2500lx，培養(yǎng)室技術(shù)要求參照附錄A。9.3培養(yǎng)方法在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。礬根采用培養(yǎng)基瓶內(nèi)一步生根法生根。將生長健壯的芽叢接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生。在無菌超凈工作臺(tái)上，用接種剪子和鑷子剪段1.0cm-1.2cm插入培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶插10株-12株。9.4根的生長根細(xì)長，通常有1條-5條根，顏色白色。正在生長的白色根吸收力強(qiáng)，移苗容易成活。8DBXXXXXXX—XXXX參考文獻(xiàn)[1]湯玲,賀歡,孔芬,韓富軍,王衛(wèi)成.草莓組織培養(yǎng)研究綜述[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,2017(9):68-71[2]張志宏,肖敏,楊洪一,等.草莓病毒脫除方法的比較與評(píng)價(jià)[J].果樹學(xué)報(bào),2006,23(5):720-723.[3]何歡樂,陽―靜,蔡―潤,等.草莓莖尖培養(yǎng)脫毒效果研究[J].北方園藝,2005(5):79-81.[4]王常蕓,李曉亮,王建玲,等.草莓脫毒技術(shù)與開發(fā)應(yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(4):118-122.[5]李會(huì)珍,徐東進(jìn),陳登金,等.不同植物生長調(diào)節(jié)劑對脫毒紅頰草莓組培快繁的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(2):43-45.[6]金真,王康麗,梁佳惠,等.培養(yǎng)基和外源激素對“章姬”草