氨基酸藥物的發(fā)酵生產(chǎn)

第一節(jié)氨基酸類藥物的根本概念一、氨基酸類藥物的根本知識(shí)從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有180多種，但是參與蛋白質(zhì)組成的常見(jiàn)氨基酸或稱根本氨基酸只有二十種。1986年發(fā)現(xiàn)第21種硒代胱氨酸最近發(fā)現(xiàn)第22種遺傳基因編碼的氨基酸吡咯賴氨酸。180多種天然氨基酸大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組成的，這些氨基酸被稱為非蛋白質(zhì)氨基酸。氨基酸是構(gòu)成機(jī)體蛋白質(zhì)的根本單位，且構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的氨基酸都是α-氨基酸，除甘氨酸外，α-碳原子均為不對(duì)稱碳原子，具有立體異構(gòu)現(xiàn)象，均是L-型氨基酸。1、分類：〔1〕根據(jù)氨基酸在pH5.5溶液中帶電狀況分為酸性、中性及堿性氨基酸三類。

〔2〕依R基團(tuán)差異亦分為：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸及雜環(huán)氨基酸三類其中L-組氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸及L-羥脯氨酸為雜環(huán)氨基酸，L-酪氨酸及L-苯丙氨酸為芳香族氨基酸，其余均為脂肪族氨基酸。2、性質(zhì)：〔1〕物理通性：天然氨基酸純品均為白色結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)及分解點(diǎn)均在200℃以上。在有機(jī)溶劑中溶解度一般較小。均為兩性電解質(zhì)，各有一定等電點(diǎn)。除甘氨酸外都有旋光性。氨基酸能使水的介電常數(shù)增高,而一般的有機(jī)化合物乙醇、丙酮等卻使水的介電常數(shù)降低。是以離子晶格組成，而一般的有機(jī)化合物是由分子晶格組成的。氨基酸的上述理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)與氨基酸合成、轉(zhuǎn)化、別離純化及定性定量檢測(cè)的依據(jù)二、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用

1、氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的根本組成單位，故生物體中眾多蛋白質(zhì)的生物功能，無(wú)不與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)量、排列順序及由其形成的空間構(gòu)象有密切的關(guān)系。因此氨基酸對(duì)維持機(jī)體蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡有極其重要的意義。生命活動(dòng)中人及動(dòng)物通過(guò)消化道吸收氨基酸。通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)化而維持其動(dòng)態(tài)平衡，假設(shè)其動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，那么機(jī)體代謝紊亂，甚至引起病變。臨床上常通過(guò)直接輸入氨基酸制劑改善患者營(yíng)養(yǎng)狀況，增加治療時(shí)機(jī)，促進(jìn)康復(fù)。賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等8種氨基酸必需氨基酸：人及哺乳動(dòng)物自身不能合成，需由食物供給。半必需氨基酸：氨基酸〔胱氨酸及酪氨酸〕可分別由其他氨基酸〔蛋氨酸和苯丙氨酸)產(chǎn)生，假設(shè)食物中提供了足夠的該氨基酸〔氨酸及酪氨酸〕，可減少對(duì)其他氨基酸〔蛋氨酸及苯丙氨酸〕的需求量。氨基酸〔精氨酸及組氨酸〕合成速度較低，通常難以滿足需求，需由外界補(bǔ)充一局部?！捕持委熛兰膊〉陌被峒捌溲苌铩踩持委煾尾〉陌被峒捌溲苌铩菜摹持委熌X及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物〔五〕用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物〔六〕其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用第二節(jié)氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法

1、目前全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在百萬(wàn)噸左右，其中產(chǎn)量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸，其次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中。

2、目前構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種氨基酸的生產(chǎn)方法有天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成法等四種。

3、氨基酸及其衍生物類藥物已有百種之多，但主要是以20種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?；⑷〈俺甥}等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。一、水解法〔一〕根本原理與過(guò)程以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過(guò)酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)別離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法。目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸及L-絲氨酸等。水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過(guò)程為水解、別離和結(jié)晶精制三個(gè)步驟。

1、蛋白質(zhì)水解方法目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水解法三種?！?〕酸水解法蛋白質(zhì)原料用6～10mol／L鹽酸或8mol／L硫酸于110～120℃〔回流煮沸〕水解12～24h，除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點(diǎn)是水解迅速而徹底，產(chǎn)物全部為L(zhǎng)-型氨基酸，無(wú)消旋作用。缺點(diǎn)是色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪氨酸局部被破壞，且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境?！?〕堿水解法蛋白質(zhì)原料經(jīng)6mol／L氫氧化鈉或4mol／L氫氧化鋇于100℃水解6h即得多種氨基酸混合物。該法水解迅速而徹底，且色氨酸不被破壞，但含羥基或巰基的氨基酸全部被破壞，且產(chǎn)生消旋作用。工業(yè)上多不采用?！?〕酶水解法蛋白質(zhì)原料在一定pH和溫度條件下經(jīng)蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的過(guò)程稱為酶水解法。此法優(yōu)點(diǎn)為反響條件溫和，無(wú)需特殊設(shè)備，氨基酸不破壞，無(wú)消旋作用。缺點(diǎn)是水解不徹底，產(chǎn)物中除氨基酸外，尚含較多肽類。工業(yè)上很少用該法生產(chǎn)氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨。2、氨基酸別離方法

氨基酸別離方法較多，通常有溶解度法、等電點(diǎn)沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。

〔1〕溶解度法是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑中的溶解度差異而進(jìn)行別離的方法。胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開(kāi)。

〔2〕特殊試劑沉淀法系采用某些有機(jī)或無(wú)機(jī)試劑與相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物的別離方法。如鄰二甲苯-4-磺酸能與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀，后者與氨水反響又可獲得游離亮氨酸；組氨酸可與HgC12形成不溶性汞鹽沉淀，后者經(jīng)處理后又可獲得游離組氨酸；精氨酸可與苯甲醛生成水不溶性苯亞甲基精氨酸沉淀，后者用鹽酸除去苯甲醛即可得精氨酸。

〔3〕吸附法是利用吸附劑對(duì)不同氨基酸吸附力的差異進(jìn)行別離的方法。如顆粒活性炭對(duì)苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于對(duì)其它非芳香族氨基酸的吸附力，故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸別離出來(lái)。

〔4〕離子交換法是利用離子交換劑對(duì)不同氨基酸吸附能力的差異進(jìn)行別離的方法。氨基酸為兩性電解質(zhì)，在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)不同，故同一種離子交換劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不同。L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶體，分解點(diǎn)258~261℃，pI為5.05，〔α〕25D為-232°。在25℃水中溶解度為0.011，在75℃水中為0.052。溶于無(wú)機(jī)酸及無(wú)機(jī)堿，在熱堿液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮?？杀粡?fù)原為L(zhǎng)-半胱氨酸。〔2〕工藝路線〔3〕工藝過(guò)程①水解110～117℃水解7h〔自100℃時(shí)計(jì)〕后出料,玻璃布過(guò)濾,收集濾液。②中和直至pH4.8，靜置36h，滌綸布濾取沉淀，離心甩干得L-胱氨酸粗品。③粗制升溫至65～70℃，攪拌半小時(shí)，加活性炭16kg，于80～90℃保溫半小時(shí)，濾除活性炭。調(diào)濾液至pH4.8，靜置結(jié)晶，吸出上清液后，底部沉淀經(jīng)離心甩干得胱氨酸粗品〔Ⅱ〕。④精制中和升溫至70℃，加活性炭1.5～2.5kg，85℃攪拌半小時(shí)，過(guò)濾，加1.5倍體積蒸餾水，升溫至75～80℃，攪拌下用12％氨水〔化學(xué)純〕中和至pH3.5～4.0，析出結(jié)晶，濾取胱氨酸結(jié)晶，蒸餾水洗至無(wú)氯離子，真空枯燥得L-胱氨酸成品?！?〕檢驗(yàn)應(yīng)為六角形或六角柱形白色結(jié)晶，含量在98.5％以上，枯燥失重小于0.5％，熾灼殘?jiān)∮?.2％，氯化物小于0.15％，鐵鹽小于0.001％，重金屬小于20ppm。含量測(cè)定：〔5〕作用與用途L-胱氨酸具有增強(qiáng)造血機(jī)能、升高白細(xì)胞、促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)及抗輻射作用。臨床上用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮癬及病后或產(chǎn)后繼發(fā)性脫發(fā)。2、L-亮氨酸〔L-Leucine，L-leu〕的制備〔1〕L-亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)L-亮氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，以玉米麩質(zhì)及血粉中含量最豐富，其次在角甲、棉籽餅和雞毛中含量也較多。L-亮氨酸為人體必需氨基酸之一，化學(xué)名稱為2-氨基-4-甲基戊酸或2-氨基異己酸，分子式：C6H13NO2,分子量：131.17,結(jié)構(gòu)式：L-Leu自水及乙醇中得白色片狀結(jié)晶，pI為5.98，熔點(diǎn)為293℃，在25℃水中溶解度為2.19，乙醇中為0.017;在75℃水中為3.82，在醋酸中為10.9，不溶于乙醚。〔2〕工藝路線：③濃縮、沉淀與解析上述流出液減壓濃縮至進(jìn)柱液體積的1／3，攪拌下參加1／10體積〔v／v〕的鄰二甲苯-4-磺酸，產(chǎn)生亮氨酸磺酸鹽沉淀。濾取沉淀并用2倍體積〔w／v〕去離子水?dāng)嚢柘礈靸纱?，抽濾壓干得亮氨酸磺酸鹽。濾餅加2倍體積〔w／v〕去離子水?dāng)噭?，?mol/L氨水中和至pH6～8，70～80℃保溫?cái)嚢?h，冷卻過(guò)濾。沉淀用2倍體積〔w／v〕去離子水?dāng)嚢柘礈靸纱危^(guò)濾得亮氨酸粗品。④精制L-亮氨酸粗品用40倍體積〔w／v〕去離子水加熱溶解，加0.5％活性炭于70℃攪拌脫色1h，過(guò)濾，濾液濃縮至原體積的1／4，冷卻后即析出白色片狀亮氨酸結(jié)晶。過(guò)濾收集結(jié)晶，用少量水洗滌、抽干，70～80℃烘干得L-亮氨酸成品?！?〕檢驗(yàn)應(yīng)為白色片狀結(jié)晶，含量98.5％～101.5%，枯燥失重不超過(guò)0.2％，熾灼殘?jiān)怀^(guò)0.4％，氯化物不超過(guò)0.05％，鐵鹽不超過(guò)0.003%，重金屬不超過(guò)0.0015％，砷鹽不超過(guò)1.5ppm。含量測(cè)定〔5〕作用與用途L-亮氨酸為人體必需氨基酸之一，是各種氨基酸輸液的原料之一。二、發(fā)酵法

〔－〕根本原理與過(guò)程1、發(fā)酵的根本原理生物化學(xué)中稱酵母無(wú)氧呼吸過(guò)程為發(fā)酵，反響過(guò)程中電子供體與受體皆為有機(jī)物，有時(shí)電子受體為電子供體的分解產(chǎn)物，氧化作用不完全，最終形成復(fù)原性產(chǎn)物。工業(yè)上，發(fā)酵實(shí)質(zhì)上是利用微生物細(xì)胞中酶的作用，將培養(yǎng)基中有機(jī)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞或其它有機(jī)物的過(guò)程。圖★初生氨基酸：微生物通過(guò)固氮作用、硝酸復(fù)原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相應(yīng)的氨基酸，或微生物通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一種酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸。★次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸為前體轉(zhuǎn)化成的其它氨基酸。大多數(shù)氨基酸均可通過(guò)以初生氨基酸為原料的微生物轉(zhuǎn)化作用而產(chǎn)生。目前絕大局部氨基酸皆可通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)，其缺點(diǎn)是產(chǎn)物濃度低，設(shè)備投資大，工藝管理要求嚴(yán)格，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，本錢高。本文僅以L-異亮氨酸及L-賴氨酸直接發(fā)酵法為例，說(shuō)明發(fā)酵法的根本過(guò)程。1、L-異亮氨酸〔L-Isoleucine，L-Ile〕的制備

〔1〕L-異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：L-Ile存在子所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一，分子式為C6H13NO2，分子量為131.17，結(jié)構(gòu)式為：L-Ile在乙醇中形成菱形葉片狀或片狀晶體，分解點(diǎn)為285～286℃，L-Ile溶于熱醋酸，在20℃乙醇中溶解度為0.072，在25℃水中為4.12，在75℃水中為6.08，不溶于乙醚?！?〕工藝路線〔3〕工藝過(guò)程①

菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成〔%〕為：葡萄糖2尿素0.3玉米漿2.5豆餅水解液0.1〔以干豆餅計(jì)〕pH6.5。二級(jí)種子培養(yǎng)基另加菜籽油0.4，其余同一級(jí)種子培養(yǎng)基。一級(jí)種子培養(yǎng)：1000ml三解瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30℃培養(yǎng)〔沖程7cm，頻率105次／min〕16h。二級(jí)種子培養(yǎng)：接種量3.5％，培養(yǎng)8h，如此逐級(jí)以0.2L／〔min·L〕通氣量發(fā)酵60h，在24～50h之間不斷補(bǔ)加尿素至0.6，氨水至0.27。③除菌體、酸化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100℃并維持10min，冷卻過(guò)濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過(guò)濾除沉淀。④離子交換、吸附別離上述濾液每分鐘以樹(shù)脂量1.5％的流速進(jìn)H十-型732離子交換柱〔Φ40×100cm〕，以100L去離子水洗柱，再以60℃、0.5mol／L氨水按3L/min的流速進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液。⑤濃縮趕氨合并pH3～12的洗脫液，70～80℃減壓蒸餾、濃縮至粘稠狀，加去離子水至原體積的1／4，再濃縮至粘稠狀。如此重復(fù)三次。⑥脫色、濃縮、中和上述濃縮物加去離子水至原體積的1／4，攪拌均勻，加2mol／L鹽酸調(diào)pH3.5，加上1％〔w／v〕活性炭，70℃攪拌脫色1h。濾除活性炭，濾液減壓濃縮至適當(dāng)體積，用2mol／L氨水調(diào)pH6.0，5℃沉淀過(guò)夜,過(guò)濾抽千，105℃烘干得：L-異亮氨酸半成品。⑦精制、烘干每10kgL-異亮氨酸半成品加8L濃鹽酸和20L去離子水，加熱至80℃，攪拌溶解，加10kg氯化鈉至飽和，加工業(yè)液堿調(diào)pH1.5，過(guò)濾，濾液用堿調(diào)pH1.5，5℃放置過(guò)夜。濾取沉淀，用80L，去離子水加熱至80℃攪拌溶解，加適量氯化鈉和1%〔w／v〕活性炭，70℃攪拌脫色lh過(guò)濾，濾液減壓濃縮至適當(dāng)濃度，用氨水調(diào)pH6.0，5℃放置結(jié)晶過(guò)夜。次日過(guò)濾收集結(jié)晶，抽干，于105℃烘房中烘干得L-異亮氨酸成品?！?〕檢驗(yàn)應(yīng)為菱形葉片狀或片狀晶體，含量應(yīng)為98.5％～101.5％，枯燥失重不超過(guò)0.3％，熾灼殘?jiān)淮笥诤繙y(cè)定與L-亮氨酸的規(guī)定相同。0.3%，氯化物不超過(guò)0.05％，硫酸鹽不超過(guò)0.03％，鐵鹽不超過(guò)0.003％,重金屬不超過(guò)0.0015％，砷鹽不超過(guò)1.5ppm?！?〕作用與用途L-Ile為必需氨基酸，是復(fù)方氨基酸輸液的重要成份之一。

2、L-賴氨酸〔L-Lysine，L-Lys〕的制備

〔1〕L-賴氨酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)L-賴氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一。分子量為146.20，結(jié)構(gòu)為：L-Lys自乙醇水溶液中得針狀結(jié)晶，其鹽酸鹽為單斜晶系白色粉末，無(wú)臭、味苦，熔點(diǎn)263～264℃，易溶于水，幾乎不溶于乙醇和乙醚。PI為10.56，〔2〕工藝路線〔3〕工藝過(guò)程①

菌種培養(yǎng)菌種為北京棒狀桿菌〔corymebacteriumperkinense〕ASl.563。斜面培養(yǎng)基成分〔％〕為:葡萄糖0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨0.5，瓊脂2.0，pH7.0。種子培養(yǎng)基成分〔%〕為:葡萄糖2.0，磷酸氫二鉀0.1，硫酸鎂0.05，硫酸銨0.4，玉米漿2.0，毛發(fā)水解廢液1.0，pH6.8～7.0，CaCO30.5。1000ml三角瓶中種子培養(yǎng)基裝量200ml，接種一環(huán)斜面培養(yǎng)菌種，30℃振搖〔沖程7.6cm，頻率108次／min〕，培養(yǎng)16h。③發(fā)酵液處理：離心除菌體；80℃加熱；④離子交換：銨型732樹(shù)脂;PH=5.0為飽和(串聯(lián))⑤濃縮結(jié)晶：收集PH=8.0～14.0洗脫液〔氨水洗脫〕〔二〕酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝目前醫(yī)藥工業(yè)中，用酶工程法生產(chǎn)的氨基酸已有十多種。DL-蛋氨酸、DL-纈氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-丙氨酸及DL-蘇氨酸等分別經(jīng)氨基?；覆鸱肢@得了相應(yīng)的L-氨基酸，并已投入了工業(yè)化生產(chǎn)。1、L-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備

〔1〕L-天冬氨酸及L-丙氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)①L－天冬氨酸〔L-Asparticacid，Asp〕的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)L-Asp存在于所有蛋白質(zhì)分子中，含兩個(gè)羧基和一個(gè)氨基，為酸性氨基酸，分子式為C4H7NO4，分子量為133.10，結(jié)構(gòu)式為：L-Asp的化學(xué)名稱為α-氨基丁二酸或氨基琥珀酸，純品為白色菱形葉片狀結(jié)晶，等電點(diǎn)為2.77，熔點(diǎn)為269～271℃。溶于水及鹽酸，不溶于乙醇及乙醚，在25℃水中溶解度為0.8，在75℃水中為2.88，在乙醇中為0.00016。在堿性溶液中為左旋性，在酸性溶液中為右旋性?！拨痢?5D為+5.05°〔C＝0.5～2.0，在水中〕，〔α〕25D為+25.4°〔C＝0.5～2.0，在5mol／LHCl中〕。②L-丙氨酸〔L-Alanine，簡(jiǎn)稱L-Ala〕的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)L-Ala存在于所有蛋白質(zhì)分子中,為中性氨基酸。分子式為C3H7NO2，分子量為89.09，結(jié)構(gòu)式為：L-Ala自水和乙醇中形成菱形結(jié)晶，等電點(diǎn)為6.0，分解點(diǎn)為297℃，在25℃水中溶解度為16.65，在75℃水中為28.5，在20℃乙醇中為0.16，不溶于丙酮及乙醚。〔α〕25D為+18°〔C＝0.5～2.0，在水中〕，〔α〕25D為-14.6°〔C＝0.5～2.0，在5mol／LHCl中〕?！?〕L-Asp和L-Ala的酶轉(zhuǎn)化反響〔3〕工藝路線〔2〕微囊型包埋是用直徑幾十到幾百微米、厚約25nm的半透膜將酶分子進(jìn)行包埋固定化的方法。〔3〕脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包裹空間的微球體。輔酶及偶聯(lián)酶的固定化輔酶物質(zhì)的固定化一般采用載體共價(jià)偶聯(lián)法?！?〕工藝過(guò)程①菌種培養(yǎng)大腸桿菌〔Esscherichiacoli〕AS1.881的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)基成分〔％〕為玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，MgSO4·7H2O0.02，氨水調(diào)pH6.0,煮沸后過(guò)濾，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量50～100m1。從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種于搖瓶培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)24h，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)至1000～2000L規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1mol／LHCl調(diào)pH5.0，升溫至45℃并保溫1h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)筒式高速離心機(jī)收集菌體〔含天冬氨酸酶〕，備用。德阿昆哈假單胞菌〔Pseudomonasdacunhae〕68變異株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成〔％〕為蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaC10.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基相同，唯不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為40m1。搖瓶培養(yǎng)基組成〔％〕為L(zhǎng)-谷氨酸3.0，蛋白胨0.9，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氯鉀0.05，MgSO4·7H2O0.01，用氨水調(diào)pH7.2，500ml三角瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。④轉(zhuǎn)化反響將保溫至37℃的lmol／L延胡索酸銨〔含1mmol／LMgC12，pH8.5〕底物溶液按一定空間速度〔Sv〕連續(xù)流過(guò)生物反響堆I，控制到達(dá)最大轉(zhuǎn)化率〔＞95％〕為限度，收集轉(zhuǎn)化液制備L-Asp或用于生物反響堆Ⅱ的再轉(zhuǎn)化。當(dāng)需要生產(chǎn)L-丙氨酸時(shí)，向上述轉(zhuǎn)化液中加磷酸吡哆醛至0.1mmol／L濃度，調(diào)pH6.0，保溫至37℃，按一定空間速度流入1.515×105Pa壓力下的生物反響堆Ⅱ，控制到達(dá)最大轉(zhuǎn)化率〔＞95％〕為限，收集轉(zhuǎn)化液，用于制取L-丙氨酸。產(chǎn)品純化與精制生物反響堆Ⅰ轉(zhuǎn)化液經(jīng)過(guò)濾澄清，攪拌下用1mol／LHCl調(diào)pH2.8，5℃結(jié)晶過(guò)夜，濾取結(jié)晶，用少量冷水洗滌抽干，105℃枯燥得L-Asp粗品。粗品用稀氨水溶解〔pH5〕成15％溶液，加1%〔w／v〕活性炭，70℃攪拌脫色1h過(guò)濾,濾液于5℃結(jié)晶過(guò)夜，濾取結(jié)晶，85℃真空枯燥得藥用L-Asp。生物反響堆Ⅱ轉(zhuǎn)化液過(guò)濾澄清，于60～70℃下減壓濃縮至原體積的50％，冷卻后加等體積甲醇，5℃結(jié)晶過(guò)夜，濾取結(jié)晶并用少量冷甲醇洗滌抽干，80℃真空枯燥得L-Ala粗品。粗品用3倍體積〔w／v〕去離子水于80℃攪拌溶解，加0.5%〔w／v〕藥用活性炭于70℃攪拌脫色1h，過(guò)濾，濾液冷后加等體積甲醇，5℃結(jié)晶過(guò)夜，濾取結(jié)晶，于80℃真空枯燥得藥用L－Ala?！?〕檢驗(yàn)〔6〕作用與用途L-Asp有助于鳥(niǎo)氨酸循環(huán)，促進(jìn)氨和CO2生成尿素，降低血中氨和CO2,增強(qiáng)肝功能，消除疲勞，用于治療慢性肝炎、肝硬化及高血氨癥。同時(shí)L-Asp和L-Ala都是復(fù)合氨基酸輸液的原料。2，酶拆分法制備L-苯丙氨酸〔1〕L-苯丙氨酸〔L-phenylalanine，L-phe〕的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)L-phe，存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一，其分子式為C9H11NO2，分子量為165.19，結(jié)構(gòu)為：〔3〕工藝路線〔4〕工藝過(guò)程①固定化氨基?；傅闹苽淙EAE-SephadexA-50〔二乙氨基乙基葡聚糖,G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克〕于去離子水中充分浸泡后，依次用10倍量0.5mol／LHCl和0.5mol／LNaOH溶液攪拌處理30min，再用去離子水洗至中性，然后依次用0.1mol／L及0.01mol／L的pH7.0磷酸緩沖液處理1～2h，濾干備用。另取培養(yǎng)40～50h的米曲擴(kuò)大曲用6倍量去離子水分兩次抽提，濾去殘?jiān)?。濾液用2mol／LNaOH溶液調(diào)pH6.7~7.0，按100L酶液加1kg已處理的濕DEAE-SephadexA-50的比例混合，于0～4℃攪拌吸附4～5h，濾取DEAE-SephadexA-50，依次用去離子水、0.1mol／L醋酸鈉、0.01mol／L的pH7.0磷酸緩沖液洗滌3～4次，濾干得固定化氨基酰化酶，加1％甲苯后于冷庫(kù)中貯存，備用。②Ac-DL-Phe的制備將DL-Phe、冰醋酸及醋酸酐按1∶7∶1〔w／V／v〕的比例參加反響釜中，90℃反響4～5h，回收醋酸，濃縮液加一定量去離子水，再濃縮至一定體積，冷卻結(jié)晶，濾取結(jié)晶于60℃真空枯燥得Ac－DL－Phe?！?〕檢驗(yàn)應(yīng)為白色葉片狀結(jié)晶，其含量應(yīng)在98.5％～101.5％之間，〔α〕25D為-32.3°～+34.3°，1％水溶液pH為5.4～6.0，枯燥失重應(yīng)不超過(guò)0.3％，熾灼殘?jiān)鼞?yīng)不超過(guò)0.4％，氯化物、硫酸鹽及重金屬均與異亮氨酸規(guī)定相同，砷鹽應(yīng)不超過(guò)1.5ppm，鐵鹽應(yīng)不超過(guò)0.003%。含量測(cè)定：〔6〕作用與用途L-苯丙氨酸為復(fù)合氨基注射液的重要原料之一，也是合成苯丙氨酸氮芥及對(duì)氟苯丙氨酸等抗癌藥的原料?！捕郴瘜W(xué)合成法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝?yán)碚撋纤邪被峤钥捎苫瘜W(xué)合成法制造，但在目前，只有當(dāng)采用其它方法生產(chǎn)很不經(jīng)濟(jì)時(shí)才采用化學(xué)合成法生產(chǎn)，如甘氨酸、DL-蛋氨酸及DL-丙氨酸等現(xiàn)僅介紹L-脯氨酸及L-蘇氨酸的化學(xué)合成及其別離純化工藝。1、L-脯氨酸〔L-Proline，L-Pro〕的制備〔1〕L-脯氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)L-脯氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，雞毛中含量較豐富。其化學(xué)名稱為吡咯啶-α-甲酸或吡啶烷環(huán)-2-羧酸，分子式為C5H9NO2，分子量為115.13。L-Pro自乙醇-乙醚中得白色粉末狀結(jié)晶，pI為6.3，熔點(diǎn)220～222℃。極易溶于水，不溶于乙醇及乙醚。有旋光。〔2〕合成路線:L-Pro可采用化學(xué)合成法、發(fā)酵法及蛋白質(zhì)原料水解別離法生產(chǎn)，合成法也有不同的原料和工藝。以濃硫酸為脫水劑，使L-谷氨酸與乙醇縮合成L-谷氨酸-γ-乙酯，后者經(jīng)硼氫化鉀復(fù)原即成L-Pro。反響過(guò)程〔3〕工藝路線五氯酚乙醇溶液得復(fù)鹽沉淀。3%氨水解析乙醚去雜質(zhì)。含量測(cè)定：2、L-蘇氨酸〔L-Threonine，L-Thr〕的制備〔1〕L-蘇氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)L-蘇氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一。其分子式為C4H9NO3，分子量為119.12，L-Thr純品為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，微甜，等電點(diǎn)為6.16,熔點(diǎn)為255～257℃，溶于水，不溶于乙醇、乙醚及氯仿。在堿液中不穩(wěn)定，受熱易分解為甘氨酸和乙醛。L-Thr分子中有兩個(gè)不對(duì)稱碳原子，故有L－D－Thr和L－D別蘇氨酸四種異構(gòu)體，唯L-Thr具有生理活性?！?〕合成路線:L-Thr的合成原料為甘氨酸和乙醛。甘氨酸先與堿式硫酸銅反響生成甘氨酸銅，后者在堿性條件下與乙醛縮合成DL-Thr銅，并以播種結(jié)晶法〔優(yōu)先結(jié)晶法〕拆分得L-Thr和D-Thr。反響過(guò)程為：〔3〕工藝路線第三節(jié)氨基酸輸液

多種結(jié)晶L-氨基酸依特定比例混合制成的靜脈內(nèi)輸注液謂之氨基酸輸液。氨基酸輸液可直接注入進(jìn)食缺乏者的血液中，促進(jìn)蛋白質(zhì)、酶及肽類激素的合成，提高血漿蛋白濃度與組織蛋白含量，維持氮平衡，調(diào)節(jié)肌體正常代謝。現(xiàn)已有含氨基酸數(shù)目為11、14、18及20種等多種輸液類型，氨基酸濃度分別有3％、5％、9％、10％及12％等多種規(guī)格。有些氨基酸輸液還參加山梨醇、木糖、維生素、Na＋、K＋、Ca2+或Mg2+等成分，以補(bǔ)充能量，提高氨基酸的利用率及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也有些氨基酸輸液與右旋糖酐配伍制成較理想的代血漿。一、氨基酸輸液的組成與要求輸入人體的氨基酸種類、數(shù)量及比例需符合機(jī)體要求，否那么利用度將下降，還會(huì)引起代謝失調(diào)、拮抗及中毒等代謝并發(fā)癥。

〔一〕組方原理體內(nèi)蛋白質(zhì)處于連續(xù)分解與合成的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，故氨基酸輸液以被患者的有效利用為度。目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)氨基酸輸液組方多采用人乳、全蛋白、FAO(FoodandAgricultureOrganization聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織1973年聯(lián)合國(guó)糧食組織和世界衛(wèi)生組織研究提出的符合成人需要的8種必需氨基酸FAO/WHO模式)、FA○-WHO或血漿游離氨基酸模式。組方中必須含八種必需氨基酸和兩種半必需氨基酸，所有氨基酸均為L(zhǎng)-型。另外，組方中尚需含5％山梨醇或木糖醇，以補(bǔ)充能量、促進(jìn)氨基酸的吸收和利用，同時(shí)加半胱氨酸作為穩(wěn)定劑，由此方能構(gòu)成優(yōu)良的氨基酸輸液。〔二〕處方中氨基酸的組成與比例

1、氨基酸的構(gòu)型最理想的情況是全部使用L-氨基酸配制輸液。2、必需氨基酸與非必需氨基酸的比例非必需氨基酸