HIV抗體檢測與質(zhì)量控制培訓(xùn)課件

HIV抗體檢測與質(zhì)量(zhìliàng)控制第一頁，共五十九頁。滋病毒〔人類免疫(miǎnyì)缺陷病毒〕艾滋病毒〔即人類免疫缺陷病毒〕是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，它具有極強的迅速變異能力，這一特征不僅使人體的免疫系統(tǒng)難以抵御其侵害，而且給特效治療藥物和預(yù)防用疫苗的研制帶來困難。艾滋病毒直接侵犯人體的免疫系統(tǒng)，破壞人體的細胞免疫和體液免疫。它主要存在于感染者和病人的體液〔如血液、精液、陰道(yīndào)分泌物、乳汁等〕及多種器官中，它可通過含HIV的體液交換或器官移植而傳播。第二頁，共五十九頁。病毒(bìngdú)現(xiàn)狀

在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致了近1200萬人的死亡，超過3000萬人受到感染。在感染后會整合入宿主細胞的基因組中，而抗病毒治療并不能把病毒鏟除。在2004年底，全球有約四千萬被感染并與人類免疫缺陷病毒共同生存的人，流行狀況(zhuàngkuàng)最為嚴重的仍是撒哈拉以南非洲。1986年7月25日，世界衛(wèi)生組織〔WHO〕發(fā)布公報，國際病毒分類委員會會議決定，把艾滋病病毒改稱為人類免疫缺陷病毒〔HumanImmunodeficiencyVirus〕簡稱HIV。第三頁，共五十九頁。病毒(bìngdú)特點

HIV病毒主要(zhǔyào)攻擊人體的輔助T淋巴細胞系統(tǒng)；一旦侵入機體細胞，病毒會和細胞整合在一起終生難以消除；病毒基因變化多樣；廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經(jīng)病癥的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高；對外界環(huán)境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效；感染者潛伏期長、死亡率高；艾滋病病毒的基因組比任何一種病毒基因都復(fù)雜。

第四頁，共五十九頁。體外生存(shēngcún)

人類免疫缺陷病毒在人體外生存(shēngcún)能力極差，不耐高溫，抵抗力較低，離開人體不易生存(shēngcún)，常溫下只可生存(shēngcún)數(shù)小時至數(shù)天。HIV對熱敏感。在56℃條件下30分鐘即失去活性，但在室溫保存7天，仍保持活性。第五頁，共五十九頁。滅活方法(fāngfǎ)

國際衛(wèi)生組織推薦對艾滋病病毒滅活加熱100℃持續(xù)20分鐘，效果(xiàoguǒ)較理想。第六頁，共五十九頁。

病毒(bìngdú)形態(tài)人類免疫缺陷病毒(bìngdú)直徑約120納米，大致呈球形。第七頁，共五十九頁。

致病機制(jīzhì)HIV選擇性的侵犯(qīnfàn)帶有CD4分子，主要有T淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等。第八頁，共五十九頁。傳播(chuánbō)途徑

HIV感染者是傳染源，曾從血液、精液、唾液、尿液、陰道分泌液、眼淚(yǎnlèi)、乳汁等別離得HIV。性接觸傳播血液傳播母嬰傳播第九頁，共五十九頁。

疾病診斷HIV抗體篩查試驗ELISA試驗化學(xué)發(fā)光法快速檢測補充試驗抗體確證試驗：免疫印跡試劑(shìjì)〔WB〕和條帶免疫試驗〔RIBA〕核酸試驗：核酸定性和核酸定量試驗

第十頁，共五十九頁。HIV抗體(kàngtǐ)檢測目的HIV抗體檢測可用于診斷、血液篩查、監(jiān)測等。以診斷為目的的檢測是為了確定個體HIV感染狀況，包括臨床檢測、自愿咨詢檢測、根據(jù)(gēnjù)特殊需要進行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢，包括各類高危人群、重點人群和一般人群。第十一頁，共五十九頁。HIV抗體(kàngtǐ)篩查樣品

血清/血漿(xuèjiāng)/全血濾紙干血斑口腔黏膜滲出液尿液第十二頁，共五十九頁。篩查試劑(shìjì)

國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(pīzhǔn)有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格選擇敏感性和特異性高的試劑第十三頁，共五十九頁。篩查方法(fāngfǎ)酶聯(lián)免疫吸附試驗〔ELISA〕化學(xué)發(fā)光或免疫熒光(yíngguāng)試驗〔CIA/IFA〕：采用發(fā)光或熒光(yíngguāng)底物，用發(fā)光或熒光(yíngguāng)儀測定結(jié)果快速檢測〔RT〕及其它檢測試驗

第十四頁，共五十九頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(shìyàn)〔ELISA〕HIV抗體檢測試劑〔第三代〕：檢測HIV-1/2抗體HIV抗原抗體聯(lián)合檢測試劑〔第四代〕：可同時檢測血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗體用酶標儀測定結(jié)果有效(yǒuxiào)試驗的陰性和陽性對照必須符合試劑盒規(guī)定第十五頁，共五十九頁。ELISA試驗中可能出現(xiàn)的問題(wèntí)和原因分析問題可能的原因（非試劑盒本身的原因）測定的重復(fù)性差1.加樣本及試劑量不準2.加樣過快，孔間發(fā)生污染3.加錯樣本4.加樣本和試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū)5.溫育時間、洗板、顯色時間不一致6.酶標儀濾光片問題第十六頁，共五十九頁。ELISA試驗中可能出現(xiàn)的問題和原因(yuányīn)分析問題可能的原因（非試劑盒本身的原因）白板（陽性對照不顯色）1.漏加酶結(jié)合物2.洗液配制問題，量筒不干凈含酶抑制物3.漏加顯色劑A或B4.終止液當(dāng)顯色劑使用全部板孔都有顯色1.洗板不干凈2.加底物的吸頭被酶污染3.洗板液受酶污染4.由于儀器或加樣頭造成的交叉污染第十七頁，共五十九頁。ELISA測定(cèdìng)中的干擾因素內(nèi)源性干擾(gānrǎo)因素外源性干擾因素第十八頁，共五十九頁。內(nèi)源性干擾(gānrǎo)因素

人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的有：類風(fēng)濕因子(yīnzǐ)、補體、嗜異性抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子等第十九頁，共五十九頁。外源性干擾(gānrǎo)因素常常是由于血標本(biāoběn)的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標本(biāoběn)溶血、細菌污染、標本(biāoběn)貯存時間過長、凝集不全、反復(fù)凍融等第二十頁，共五十九頁。分析ELISA測定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性(yīnxìng)結(jié)果時，需綜合考慮試劑因素、操作因素和標本因素等。第二十一頁，共五十九頁。ELISA法結(jié)果(jiēguǒ)判斷臨界值概念:將檢測的陽性和〔或〕陰性對照的OD值代入計算公式計算出來的判斷陽性和陰性結(jié)果的界值判斷標準:標本OD值與臨界值的比值大于等于1(S/CO≥1)為陽性注意:不同廠家(chǎnɡjiā)、不同方法臨界值計算公式不同第二十二頁，共五十九頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(shìyàn)〔ELISA〕優(yōu)點：準確性高、價格低廉、判斷結(jié)果標準客觀、結(jié)果便于(biànyú)記錄和保存用途：流行病學(xué)監(jiān)測及臨床大量標本的檢測第二十三頁，共五十九頁。化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(shìyàn)采用發(fā)光或熒光(yíngguāng)底物既可檢測抗體，也可聯(lián)合檢測抗原抗體酶或熒光標記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物用發(fā)光儀或熒光儀測定結(jié)果第二十四頁，共五十九頁?！?〕免疫滲濾(shènlǜ)試驗：斑點免疫膠體金〔或膠體硒〕快速試驗以硝酸纖維膜為載體HIV抗原點狀固定在膜上加待檢樣品陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點有效試驗的質(zhì)控點必須顯色快速檢測(jiǎncè)〔RT〕及其它檢測(jiǎncè)試驗第二十五頁，共五十九頁。斑點免疫(miǎnyì)膠體金快速診斷試驗第二十六頁，共五十九頁。〔2〕免疫層析(cénɡxī)試驗：以硝酸纖維膜為載體HIV抗原線狀固定在膜上待檢樣品〔血液、唾液或尿液〕沿著固相載體遷移陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶有效試驗的質(zhì)控帶必須顯色第四代快速試劑〔SD〕：可區(qū)分抗原抗體(kàngtǐ)的檢測第二十七頁，共五十九頁。第二十八頁，共五十九頁。全血樣品(yàngpǐn)加50ul樣品于樣品墊中手指(shǒuzhǐ)血方法靜脈血方法(fāngfǎ)加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果快速檢測〔RT〕及其它檢測試驗第二十九頁，共五十九頁。病人(bìngrén)條質(zhì)控條第三十頁，共五十九頁。第三十一頁，共五十九頁?？焖?kuàisù)檢測〔RT〕及其它檢測試驗優(yōu)點:快速單份標本(biāoběn)檢測不需額外試劑或設(shè)備操作簡便缺點:肉眼判斷較主觀價格較貴結(jié)果不易保存〔建議拍照保存〕第三十二頁，共五十九頁。HIV篩查試劑(shìjì)的選擇檢測目的實驗設(shè)施條件價格其他(qítā)：檢測數(shù)量、標本用量、復(fù)檢問題、習(xí)慣等等第三十三頁，共五十九頁。試劑-1有反應(yīng)

無反應(yīng)

試劑1雙份或雙孔檢測或兩種試劑*均有反應(yīng)

一有反應(yīng),一無反應(yīng)

均無反應(yīng)補充實驗報告HIV抗體陰性

圖2使用抗體檢測試劑的檢測流程*兩種試劑可以是原有試劑加另一種試劑，也可以是兩種不同試劑。臨床診斷相關(guān)的檢測策略(cèlüè)使用抗體檢測試劑的篩查檢測流程第三十四頁，共五十九頁。HIV抗體篩查結(jié)果(jiēguǒ)的意義及處理陰性(yīnxìng)：真陰性(yīnxìng)未感染HIV病毒假陰性注意窗口期陽性：真陽性感染HIV病毒假陽性非特異性反響操作失誤處理：篩查試驗無反響報告為“HIV抗體陰性〞；有反響必須進行復(fù)檢，復(fù)檢兩次檢測均無反響報告為“HIV抗體陰性〞，復(fù)檢檢測均有反響或一個有反響一個無反響需進行“補充試驗〞；報告為“HIV感染待確定〞，不能出具陽性報告。第三十五頁，共五十九頁。補充(bǔchōng)試驗

是通過(tōngguò)檢測樣本中是否存在艾滋病病毒抗體或者核酸確定艾滋病病毒感染的檢測方法。補充試驗包括抗體確證試驗[免疫印跡試驗、條帶/線性免疫試驗，特定條件下的替代檢測〔三種酶聯(lián)免疫、三種快速試驗或酶聯(lián)加快速試驗〕，免疫層析和核酸檢測試驗〔核酸定性檢測和核酸定量檢測試驗〕第三十六頁，共五十九頁。HIV抗體(kàngtǐ)確證試驗確證試驗的試劑：必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、在有效期內(nèi)的試劑。確證樣品：可采用血清、血漿、濾紙干血斑確證試驗方法：免疫印跡試驗、條帶/線性免疫試驗，特定條件下的替代檢測〔三種(sānzhǒnɡ)酶聯(lián)免疫、三種(sānzhǒnɡ)快速試驗或酶聯(lián)加快速試驗〕，免疫層析或免疫滲濾試驗第三十七頁，共五十九頁。條帶免疫試驗(shìyàn)〔RIBA〕/重組免疫印跡法〔萬泰〕第三十八頁，共五十九頁。陽性免疫印跡試驗（WB/RIBA）陰性不確定核酸試驗或2-4周后隨訪出現(xiàn)HIV-2指示帶根據(jù)情況進一步檢測HIV-2報告HIV-1抗體陰性報告HIV-1抗體陽性圖5免疫印跡(yìnjì)試劑〔WB/RIBA〕試驗流程抗體(kàngtǐ)確證試驗檢測流程第三十九頁，共五十九頁。HIV抗體WB及RIBA/LIA試驗結(jié)果報告：〔1〕符合HIV-1抗體陽性(yángxìng)判斷標準，報告“HIV-1抗體陽性(yángxìng)〞，并按規(guī)定做好檢測后咨詢和疫情報告。符合HIV-2抗體陽性(yángxìng)判斷標準，報告“HIV-2抗體陽性(yángxìng)〞，并按規(guī)定做好檢測后咨詢和疫情報告。〔2〕符合HIV抗體陰性判斷標準，報告“HIV抗體陰性〞。如疑似“窗口期〞感染，建議2-4周后隨訪或進一步做HIV核酸檢測，盡早明確診斷?！?〕符合HIV抗體不確定判斷標準，報告“HIV抗體不確定〞，在備注中應(yīng)注明“2-4周后復(fù)檢〞或盡快做核酸檢測?？贵w確證試驗檢測(jiǎncè)報告第四十頁，共五十九頁。WB不確定(quèdìng)結(jié)果原因：HIV感染早期HIV感染晚期非特異性反響污染處理：核酸檢測(jiǎncè)2-4周后隨訪重采血

第四十一頁，共五十九頁。HIV-1核酸檢測HIV-1核酸定性檢測HIV-1核酸定量試驗有反應(yīng)報告HIV-1核酸陽性無反應(yīng)報告HIV-1核酸陰性報告低于檢測限>5000cps/ml,報告檢測值≤5000cps/ml重新采樣檢測高于檢測限低于檢測限圖８ＨＩＶ核酸試驗(shìyàn)流程臨床診斷相關(guān)(xiāngguān)的檢測策略第四十二頁，共五十九頁。核酸(hésuān)補充試驗報告定性檢測結(jié)果有反響，報告“HIV-1核酸陽性〞；無反響，報告“HIV核酸陰性〞。定量檢測結(jié)果低于檢測限，報告低于檢測限；檢測結(jié)果大于5000CPs/ml，報告檢測值；檢測結(jié)果低于等于5000CPs/ml，盡快再次嚴格按核酸檢測的要求(yāoqiú)采樣檢測，報告檢測值。臨床醫(yī)生可結(jié)合臨床及流行病史、CD4+T淋巴細胞檢測值或者HIV-1抗體隨訪檢測結(jié)果等進行診斷或排除診斷。第四十三頁，共五十九頁。HIV抗體母親(mǔqīn)HIV抗體經(jīng)胎盤進入胎兒，出生時新生兒和嬰兒早期抗體陽性，不一定是感染出生時母親的抗體，80~90%在生后9~12個月消失，出生后18個月根本上全部消失18個月后兒童HIV抗體仍然陽性，視為自身感染產(chǎn)生的抗體18個月以下(yǐxià)嬰幼兒的HIV診斷第四十四頁，共五十九頁。嬰幼兒HIV感染(gǎnrǎn)的抗體檢測適用于：HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)(chūxiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床疑心HIV感染的兒童。嬰兒12個月時進行HIV抗體檢測陰性排除感染，納入正常兒童保??；陽性者繼續(xù)追蹤隨訪，至18個月再次進行HIV抗體檢測，結(jié)果陰性排除感染。第四十五頁，共五十九頁。HIV抗體(kàngtǐ)檢測的要點根據(jù)目的選擇檢測方法及檢測策略。嚴格遵守實驗室標準操作程序〔SOP〕。結(jié)果判定(pàndìng)以試劑盒說明書為標準。篩查試驗有反響，須作補充試驗第四十六頁，共五十九頁。質(zhì)量(zhìliàng)控制

質(zhì)量控制是指為確保實驗(shíyàn)工作正常進行而在每一次實驗(shíyàn)過程中必須采取的各種措施。以保證檢驗結(jié)果到達允許的準確度。第四十七頁，共五十九頁。實驗前質(zhì)量控制

正確的標本采集和處理正確及時的運送樣品實驗前正確地處理和保存樣品實驗中質(zhì)量控制

儀器校準選擇合格試劑，采用正確的檢測方法標準程序質(zhì)控品的準備開展質(zhì)控圖質(zhì)控

實驗后質(zhì)量控制

結(jié)果記錄記錄核對(héduì)結(jié)果解釋記錄保存

質(zhì)量(zhìliàng)控制第四十八頁，共五十九頁。實驗(shíyàn)前質(zhì)量控制樣品的采集：實驗室應(yīng)根據(jù)待測工程選用適當(dāng)?shù)姆椒ú杉瘶悠贰？贵w檢測可采集血清、血漿和全血；CD4+T淋巴細胞檢測可采集K3EDTA或肝素或枸櫞酸鈉抗凝全血，并在24小時內(nèi)室溫(shìwēn)送檢；HIV-1病毒載量測定可采集EDTA或枸櫞酸鈉(ACD)抗凝全血，最好在6小時內(nèi)離心別離血漿和血細胞。將別離的血漿分裝到2-3支，冰凍保存，在凍存管上編號。做好樣品處理記錄并注明分裝時間。第四十九頁，共五十九頁。實驗(shíyàn)前質(zhì)量控制樣品的保存：用于HIV抗體檢測的血清和血漿樣品,應(yīng)存放于-20℃以下，短期〔1周〕內(nèi)進行檢測的樣品可存放于2-8℃；用于CD4+T淋巴細胞檢測的樣品應(yīng)在室溫下〔1823℃〕保存，防止極端溫度〔冷凍或過熱〕,樣品采集(cǎijí)時間超過72h那么不可檢測；用于病毒載量檢測的樣品的保存條件應(yīng)根據(jù)血漿檢測時間而定，4天內(nèi)可在4℃暫時保存，3個月以內(nèi)凍存于-20℃以下，3個月以上應(yīng)置于-70℃以下保存。血漿樣品凍融次數(shù)不可超過3次。每次凍融在樣品上標明。第五十頁，共五十九頁。實驗前質(zhì)量(zhìliàng)控制樣品的運輸：1、樣品送檢時需與相應(yīng)送樣單同時送檢。2、血清和血漿樣品在2-8℃條件下由專人低溫(dīwēn)運輸。3、CD4+T淋巴細胞檢測樣品需在在室溫下〔1823℃〕運送，防止極端溫度〔冷凍或過熱〕。超過37℃的溫度會破壞細胞，對血液學(xué)和流式細胞儀的檢測有影響。4、病毒載量測定樣品的運送：凍存的血漿樣品在運輸過程中要保持樣品在冷凍狀態(tài)，防止樣品凍融。在4℃暫時保存的樣品，在2-8℃條件下低溫運輸?？鼓獦悠吩?4小時內(nèi)2-8℃條件下低溫運輸。第五十一頁，共五十九頁。實驗前質(zhì)量(zhìliàng)控制運輸(yùnshū)采用WHO提出的三級包裝系統(tǒng)第一層容器：裝樣品，要求防滲漏第二層容器：要求耐受性好、防滲漏、容納并保護第一層容器，可以裝假設(shè)干個第一層容器。第三層容器：放在一個運輸用外層包裝內(nèi)，應(yīng)易于消毒第五十二頁，共五十九頁。實驗前質(zhì)量(zhìliàng)控制樣品編號:實驗室應(yīng)建立和標準對待檢樣品的唯一識別標記的編碼規(guī)那么，不同檢測工程〔抗體檢測、CD4+T淋巴細胞檢測和病毒載量檢測〕要采用(cǎiyòng)不同的編號系統(tǒng)。一般應(yīng)包括檢測工程、年份代碼、樣品順序號等?？稍谑諛訒r用不干膠紙打出編號條，