DB32-T 4367-2022 飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定 時間分辨熒光免疫層析定量法

ICS

65.120CCS

B4632 DB

32/T

4367—2022飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定時間分辨熒光免疫層析定量法

of

in

resolved

quantitative

09

江蘇省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布 前 言

.............................................................................

III1

范圍

................................................................................

12

規(guī)范性引用文件

......................................................................

13

術(shù)語和定義

..........................................................................

14

原理

................................................................................

15

試劑和材料

..........................................................................

26

儀器和設(shè)備

..........................................................................

37

樣品制備

............................................................................

38

樣品前處理

..........................................................................

39

標準曲線制定

........................................................................

310

檢測過程

...........................................................................

311

結(jié)果計算

...........................................................................

412

方法性能

...........................................................................

4DB

32/T

4367—2022 本文件按照GB/T

—《標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省家禽科學(xué)研究所、上海雄圖生物科技有限公司。本文件主要起草人：施壽榮、汪勁能、張鵬飛、肖蘊祺、胡艷、邵丹、沈一茹、張珊、王強。IIIDB

32/T

4367—20221 范圍本文件規(guī)定了飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品制備、樣品前處理、標準曲線制定、檢測過程、結(jié)果計算和方法性能。本文件適用于飼料原料、濃縮飼料、配合飼料、精料補充料等試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T

飼料

GB/T

20195動物飼料

試樣的制備3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1時間分辨熒光微球

resolved

形狀為球形，直徑在幾納米至幾十微米之間，微球表面或內(nèi)部負載有熒光物質(zhì)，在受到一定的能量激發(fā)時能夠發(fā)出熒光的微粒，比普通熒光半衰期長。微球表面修飾有合適密度的羧基或其它功能基團，用于與蛋白或抗體的共價偶聯(lián)；微球所包理的鑭系稀土元素經(jīng)過了鰲合，無需解離增強步驟。3.2時間分辨熒光免疫層析定量法time

resolved

fluorescence

immunochromatographyquantitative

4 原理試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與時間分辨熒光微球標記的特異性抗體結(jié)合后，抑制了層析過程中標記抗體與試紙條

T

線脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗原的免疫反應(yīng)，使

T

線時間分辨熒光強度降低，質(zhì)控線

C線結(jié)合的熒光標記物濃度與樣品中玉米赤霉烯酮的濃度無關(guān)。層析結(jié)束后，通過儀器檢測計算試紙條T

線和

C

線的時間分辨熒光強度比值和設(shè)定的標準曲線進行準確定量分析。DB

32/T

4367—20225試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的二級水。·5.1 十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4

12H2O）?！?.2 磷酸二氫鉀（2PO4）。5.3 氯化鉀（）。5.4 氯化鈉（NaCl）。5.5 鹽酸（HCl）。5.6 甲醇（CH3OH）。5.7 蔗糖（C12HO11）。5.8 牛血清白蛋白（BSA。5.9吐溫（C58H114O26）。5.10磷酸鹽緩沖溶液：取

2.178

g

磷酸氫二鈉（5.1）、0.144

g

磷酸二氫鉀（）、0.12

g

氯化鉀（5.3）、

g

氯化鈉（

1

L

水中，用適量鹽酸（5.5）調(diào)

pH

至

6.8～。5.11 提取液：取

甲醇（5.6）用純水定容至

1

L，用于樣品提取。5.12 稀釋液：在

1

L

磷酸鹽緩沖溶液（5.10）中分別加入

g

蔗糖（）、

g

牛血清白蛋白（5.8）和

2.0

g

-20（5.9）混勻，用于樣品上清的稀釋。5.13 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液：濃度

。5.14 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準儲備液：取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液（5.13）1

mL

于

2

瓶中，用甲醇（5.6）定容，混合均勻，制備成濃度為

100

mg/L

的儲備液。5.15ID

卡：用于存儲標準曲線和項目信息，直接插入熒光免疫定量分析儀使用。5.16 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時間分辨熒光免疫層析定量試紙條（圖

1

μg/kg。試紙條結(jié)構(gòu)圖如下：圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時間分辨熒光免疫層析定量試紙條結(jié)構(gòu)示意圖注：結(jié)合墊包被熒光微球標記的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗體，

線包被脫氧雪腐鐮刀菌烯醇封閉抗原，

線包被二DB

32/T

4367—20225.17 陰性樣本：玉米基質(zhì)空白樣本，嘔吐毒素含量＜25

6 儀器和設(shè)備6.1 天平：感量

0.01

g，最大量程

g。6.2 渦旋振蕩器：0

r/min～

r/min。6.3離心機：轉(zhuǎn)速≥4000

。6.4 微量可調(diào)移液器：20μL～200

μL，

～1

mL。6.5 干式恒溫孵育器：37.0℃

±

2.0℃（不帶鼓風(fēng)）。6.6 時間分辨熒光免疫定量分析儀：激發(fā)波長：

±

5

nm、發(fā)射波長：615

nm

±

5

nm，用于讀取試紙條的熒光信號并自動計算定量的檢測結(jié)果。7 樣品制備按

GB/T

GB/T

20195

制樣備用。8 樣品前處理8.1 稱取

1.0

g

±

0.02

g

樣品于

10

離心管中，用移液器（

5

提取液（渦旋振蕩器（6.2

5

，用離心機（）4000

r/min

1

min，上清備用；如果樣品濃度過高，用提取液（）稀釋。8.2 取

100

μL

樣品提取液（），加入到

μL

稀釋液（5.12），混勻后待點樣檢測。9標準曲線制定9.1 空白基質(zhì)溶液制備：取

10

g

離心管中，加入

50

提取液（振蕩器（）振蕩提取

5

min，用離心機（）

r/min

離心

1

min，上清備用。9.2分別吸取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準儲備液（）0.000

mL、0.004

、

mL、0.020

mL、0.060

mL、0.120

mL、

mL、0.300

、0.400

mL

于

5

mL

容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液（9.1）定容，分別相當于

0

ng/mL、20

ng/mL、50

ng/mL、

ng/mL、

ng/mL、

ng/mL、1000

ng/mL、1500

和

2000

ng/mL

濃度標準工作溶液。9.3 取

100

μL

標準工作液（9.2）分別加入

600

μL

稀釋液（），混勻后由低濃度到高濃度進行檢測（10）。儀器軟件可根據(jù)

T

線信號值與

C

線信號值的比值（T/C）和標準工作溶液濃度的自然對數(shù)值（Inc）建立標準曲線。9.4 同批次試紙條只需建立一次標準曲線，將建立好的標準曲線與項目信息存儲于

ID

卡中，便于樣品隨時隨地檢測。10 檢測過程10.1 將干式恒溫孵育器（6.5）開機，設(shè)置溫度

37℃，待溫度升至

10.2 時間分辨熒光免疫定量分析儀（6.6）預(yù)熱

5

min

后，插入試紙條所對應(yīng)的

卡（DB

32/T

4367—202210.3從鋁箔袋中取出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇熒光免疫定量檢測試紙條（5.16），水平放置于干式恒溫孵育器（10.4 用移液器（）吸取

μL

經(jīng)過前處理的待測樣品（8.2）加入試紙條的加樣孔中，蓋上孵育器蓋開始計時孵育

6

。10.5 孵育結(jié)束后將試紙條（）插入熒光免疫定量分析儀（）的試紙條插槽中，點擊讀數(shù)。11結(jié)果計算樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量以質(zhì)量分數(shù)

X

計，數(shù)值以微克每千克（μg/kg）表示。儀器按如下公式自動計算。X=

P×V×n×1000m×1000

(1)式中：P—從標準曲