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文檔簡介

第七章食品中常見病原微生物檢驗(yàn)技術(shù)我國衛(wèi)生部公布的食品微生物目的有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。致病菌:可以引起人類發(fā)病的細(xì)菌。對不同的食品和不同的場所,應(yīng)該選擇一定的參考菌群進(jìn)展檢驗(yàn)。一、生物學(xué)特性是一大群在血清學(xué)上相關(guān)的革蘭氏陰性桿菌,無芽孢、無莢膜,周身鞭毛,能運(yùn)動的需氧或兼性厭氧短桿菌。最適生長溫度為35℃~37℃,最適pH為7.2~7.4,較抗寒,能耐受較高鹽濃度。第一節(jié)沙門氏菌檢驗(yàn)技術(shù)不分解乳糖〔亞利桑那菌除外〕。分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣〔傷寒沙門菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣〕。多數(shù)產(chǎn)生H2S,不產(chǎn)生靛基質(zhì),不液化明膠,不分解尿素,不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,多數(shù)能利用枸櫞酸鹽,能復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽,在氰化鉀培育基上不生長。沙門菌生物學(xué)性狀

目前至少有67種O抗原和2500個以上血清型,根據(jù)其對宿主的致病性,可分為三類傷寒桿菌副傷寒桿菌(甲、乙、丙)人腸熱癥鼠傷寒桿菌腸炎桿菌豬霍亂桿菌兒童傷寒人、動物急性胃腸炎豬霍亂桿菌、丙型副傷寒桿菌鼠傷寒桿菌、腸炎桿菌敗血癥沙門氏菌屬(Salmonella)

二、檢驗(yàn)所需器材三、檢驗(yàn)程序沙門氏菌檢驗(yàn)程序2021SN方法:以無菌方式進(jìn)展多點(diǎn)取樣25g+225ml緩沖蛋白胨水,經(jīng)37℃水浴4h培育,進(jìn)展非選擇性增菌;確保瀕于死亡的細(xì)菌進(jìn)展復(fù)活。其后移取10ml轉(zhuǎn)種于盛有100ml四硫磺酸鹽煌綠增菌液,經(jīng)42±1℃培育20±2h,進(jìn)展選擇性的增菌;使目的菌優(yōu)勝出來。將增菌液搖勻,以無菌操作,分別接種DHL和BS平板上于37℃培育24±2h,進(jìn)展分別培育;使目的菌分別出來。察看每個平板上的菌落,選取3-5個菌落接種于TSI或尿素酶瓊脂上,于37℃中培育24±2h,進(jìn)展挑選實(shí)驗(yàn);將符合沙門氏菌特征的TSI中的培育物,接種于營養(yǎng)瓊脂平板上,37℃中培育24±2h,進(jìn)展純化培育;選取單個菌落,接種于20E微量生化管中,進(jìn)展API生化鑒定;同時取單個菌落,在干凈的玻板上,作血清學(xué)鑒定。四、操作方法

分五個步驟:

1.前增菌2.選擇性增菌3.選擇性平板分別4.生化實(shí)驗(yàn)5.血清型分型鑒定

四、操作方法分五個步驟:1.前增菌:用無選擇性的培育基使處于瀕死形狀的細(xì)菌恢復(fù)活力;BPW2.選擇性增菌:使沙門氏菌優(yōu)勢繁衍,其它細(xì)菌遭到抑制;SC+TTBSC〔亞硒酸鹽胱氨酸增菌液〕TTB〔四硫磺酸鈉煌綠增菌液〕 胱氨酸促生長 四硫酸鈉和煌綠抑菌 氯化鎂和孔雀綠抑菌適宜傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長,37℃適宜其他沙門菌生長,42℃,18~24h.為防漏檢宜SC+TTB3.選擇性平板分別培育:BS+XLD/HE/顯色培基4.生化實(shí)驗(yàn):〔1〕初步生化實(shí)驗(yàn):三糖鐵實(shí)驗(yàn)〔2〕對疑似沙門氏菌繼續(xù)作系統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)最低限制生化實(shí)驗(yàn):靛基質(zhì)、尿素、KCN、賴氨酸。鑒定分別出來的細(xì)菌能否符合沙門氏菌的生化譜,可采用API20E等成套生化試劑5.血清型分型鑒定A-F多價(jià)O血清:把ABCDEF各群含有的共同O抗原的抗體混合起來作成混合血清。位相變異實(shí)驗(yàn)原理:在半固體培育基中參與知相的血清,使解離出的知相的菌體和血清發(fā)生反響,這樣知相的菌體就不能運(yùn)動了,未知相的菌不能和血清發(fā)生反響,可以運(yùn)動,并被解離出來。血清學(xué)鑒定:特異性診斷血清鑒定到種〔一〕增菌培育前增菌稱取25g〔mL〕樣品放入盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中,以8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min。假設(shè)樣品為液態(tài),不需求均質(zhì),振蕩混勻。如需測定pH值,用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中,如運(yùn)用均質(zhì)袋,可直接進(jìn)展培育,于36℃±1℃培育8h~18h。如為冷凍產(chǎn)品,應(yīng)在45℃以下不超越15min,或2℃~5℃不超越18h解凍。增菌悄然搖動培育過的樣品混合物,移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi),于42℃±1℃培育18h~24h。同時,另取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi),于36℃±1℃培育18h~24h。分別分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán),劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板〔或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培育基平板〕。于36℃±1℃分別培育18h~24h〔XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培育基平板〕或40h~48h〔BS瓊脂平板〕,察看各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表1。<國標(biāo)>檢測沙門氏菌方法分5個步驟:1.前增菌:在含有營養(yǎng)的非選擇性培育基中增菌,使受損傷的沙門氏菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理形狀。沙門氏菌檢測中前增菌的目的是使沙門氏菌恢復(fù)其活力。檢測經(jīng)過加工的食品中的沙門氏菌需求前增菌主要由于加工過程中沙門氏菌遭到損傷而處于瀕死形狀。2.選擇性增菌在含選擇性抑制劑的培育基中,樣品進(jìn)一步增菌。沙門沙門氏菌檢測中增菌的目的是使沙門氏菌以外的細(xì)菌〔主要是艾希氏菌屬〕遭到抑制,而使沙門氏菌得到一定的增殖,提高沙門氏菌的檢出率。

3.選擇性平板分別劃線接種于:BS和XLD瓊脂平板或HE瓊脂平板各一個,于36+1℃分別培育18—24小時(XLD、HE)或40—48小時(BS)。這一步采用固體選擇性培育基,抑制非沙門氏菌的生長,提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。亞硫酸鉍瓊脂(BS瓊脂)上典型特征木糖賴氨酸脫氧膽鹽〔XLD〕瓊脂上典型特征HE瓊脂上典型特征〔三〕生化實(shí)驗(yàn)挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落,接種于三糖鐵瓊脂培育基中。在三糖鐵瓊脂內(nèi),各菌屬的主要反響結(jié)果如表5—3。表5—2闡明在三糖鐵瓊脂內(nèi)只需斜面產(chǎn)酸同時H2S陰性的菌株可排除,其他的反響結(jié)果均有沙門氏菌的能夠,同時均有不是沙門氏菌的能夠,都需求作進(jìn)一步的生化實(shí)驗(yàn),必要時作涂片染色鏡檢(沙門氏菌為革蘭氏陰性短桿菌)。4.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)挑選挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落,接種于三糖鐵瓊脂培育基中。排除大多數(shù)非沙門氏菌。也提供了沙門氏菌培育物菌屬的初步鑒定。TSI(三糖鐵)培育基大腸桿菌和沙門氏菌腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反響結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣硫化氫可能的菌屬和種-++/-+沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+++/-+沙門氏菌Ⅲ、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌-++-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌,普羅菲登斯菌屬-+--傷寒沙門氏菌,雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌,普羅菲登斯菌屬+++/--大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌注:+陽性;-陰性;+/-多數(shù)陽性,少數(shù)陰性沙門菌常用生化實(shí)驗(yàn)?zāi)蛩孛笇?shí)驗(yàn)陰性〔黃〕陽性〔紅〕靛基質(zhì)對看管陰性(-)陽性(+)三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)培育基內(nèi),沙門氏菌屬的反響結(jié)果見表2。

表2闡明,在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸,底層產(chǎn)酸,同時賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)陰性的菌株可以排除。其他的反響結(jié)果均有沙門氏菌屬的能夠,同時也均有不是沙門氏菌屬的能夠。

2

、接種蛋白胨水〔供做靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)〕尿素瓊脂〔pH7.2〕氰化鉀〔KCN〕將已挑菌落的平板儲存于2℃-5

或室溫至少保管24h,以備必要時復(fù)查。

P150〔1〕

A1:典型反響斷定為沙門氏菌屬。如尿素、氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常,按表可斷定為沙門氏菌屬。如有2項(xiàng)異常,為非沙門氏菌屬。

〔2〕A2:補(bǔ)做甘露醇和山梨醇實(shí)驗(yàn),沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性,但需求結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)展斷定。

〔3〕A3:補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌,同時賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。

〔4〕必要時進(jìn)展沙門氏菌生化群的鑒別。

醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性〔黃〕陰性鄰硝基酚β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)〔ONPG實(shí)驗(yàn)〕

鄰硝基酚β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)〔ONPG實(shí)驗(yàn)〕

(1)原理:乳糖發(fā)酵過程中需求乳糖通透酶和β-半乳糖苷酶才干快速分解。有些細(xì)菌只需半乳糖苷酶,因此只能緩慢發(fā)酵乳糖,一切乳糖快速發(fā)酵和緩慢發(fā)酵的細(xì)菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷〔O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG〕而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。(2)方法:將待試菌接種于ONPG肉湯中,35℃水浴或孵箱孵育18~24h,察看結(jié)果。(3)結(jié)果:呈現(xiàn)亮黃色為陽性,無色為陰性。(4)運(yùn)用:可用于緩慢發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定,本法對于迅速及緩慢分解乳糖的細(xì)菌均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為實(shí)驗(yàn)陽性,而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。腸桿菌科各屬生化反響初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫(H2S)靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果A1+---+沙門氏菌屬A2++--+沙門氏菌屬(少見)緩慢愛德華氏菌A3+-++-弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌A4++++-普通變形桿菌B1--------+-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B2--++---+-大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3----+/-++++-克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4-++/-+-摩根氏菌,普羅菲登斯菌屬注1:三糖鐵瓊脂底層均產(chǎn)酸,不產(chǎn)氣者可排除;斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。注2:KCN和賴氨酸可選作其中一項(xiàng),但不能判定結(jié)果時,仍需補(bǔ)做另一項(xiàng)。注3:+表示陽性;-表示陰性;+/-表示多數(shù)陽性,少數(shù)陰性。接種三糖鐵瓊脂的同時,還要接種蛋白胨水,pH7.2尿素瓊脂、KCN培育基和賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)培育基及對照培育基各一管,于36+1℃培育18~24小時,必要時可延伸至48小時,按表5-3斷定結(jié)果。沙門氏菌的結(jié)果應(yīng)屬于A1、A2和B1,其他五種反響結(jié)果均可以排除。反響序號A1,典型反響斷定為沙門氏菌屬。假設(shè)尿素、KCN和賴氨酸三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常,按表5-4仍可斷定為沙門氏菌,如有兩項(xiàng)異常,那么按A3斷定為枸櫞酸桿菌。5.血清學(xué)分型鑒定

提供培育物菌種的鑒定。用分別出的沙門氏菌與知A-F多價(jià)O血清及H因子進(jìn)展玻片凝集實(shí)驗(yàn)。1〕抗原的預(yù)備2〕O抗原的鑒定用A—F多價(jià)O血清做玻片凝集實(shí)驗(yàn),以生理鹽水做對照。3〕H抗原的鑒定4〕Vi抗原的鑒定〔五〕菌型的斷定和結(jié)果報(bào)告綜合以上生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果,按照常見沙門氏菌抗原表及其補(bǔ)充表斷定菌型,并報(bào)告結(jié)果。假設(shè)結(jié)果為陰性,那么報(bào)告為“未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌〞。目前,對于沙門氏菌的檢驗(yàn)技術(shù)已有很大進(jìn)展.一些快速檢驗(yàn)方法已有運(yùn)用。如熒光抗體技術(shù)檢驗(yàn)食品中沙門氏菌已在國際二得到公認(rèn),其些國家作為商品消費(fèi)的熒光抗體試劑箱.即可運(yùn)用于沙門氏菌的快速檢驗(yàn)。我國在這方面也獲得一定的進(jìn)展,如固相載體吸附免疫技術(shù)、免疫染色法,酶聯(lián)A蛋白染色等快速檢驗(yàn)方法均具有快速、方便、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確等特點(diǎn),還有許多新方法、新技術(shù)仍處在實(shí)驗(yàn)和研討階段,有待于我們?nèi)パ杏懹懻?,以便更好效力于?shí)際。

指示系統(tǒng) 指示效果及可疑菌落特點(diǎn)BS 葡萄+H2S 黑色有金屬光澤、棕褐或灰色,周圍培基黑或棕色,或不產(chǎn)硫化氫而呈灰綠色DHL 乳糖+H2S 乳糖〔+〕:粉紅色,〔-〕:無色半透明無色半透明,產(chǎn)硫化氫者中心黑色SS 乳糖+H2S HE 乳糖+H2S 乳糖〔+〕:黃色,〔-〕:藍(lán)色藍(lán)綠色或藍(lán)色,產(chǎn)硫化氫者中心黑色沙門氏菌檢測

--概述原理:沙門氏菌為革蘭氏陰性短桿菌,無芽孢,普通無莢膜,周生鞭毛〔雞白痢和雞傷寒沙門氏菌除外〕。兼性厭氧,最適生長溫度37℃。在普通顯微鏡下和在普通培育基中不能與大腸桿菌進(jìn)展區(qū)分。但沙門氏菌不發(fā)酵乳糖,在腸道菌鑒別培育基上構(gòu)成無色透明菌落,而易與大腸桿菌區(qū)別。沙門氏菌有著復(fù)雜的抗原構(gòu)造,普通分為菌體〔O〕抗原、鞭毛〔H〕抗原和毒力〔Vi〕抗原三種。沙門氏菌屬包括2000個以上血清型,但多數(shù)國家從人體、動物和食品中經(jīng)常分別到有40~50種血清型。致病性中毒景象沙門氏菌檢測

--檢測方法GB前增菌,用無選擇性的培育基使處以瀕死形狀的沙門氏菌恢復(fù)活力選擇性增菌,使沙門氏菌得以繁衍,而大多數(shù)的其他細(xì)菌遭到抑制選擇性平板分別沙門氏菌生化實(shí)驗(yàn),鑒定到屬血清學(xué)分類型鑒定。沙門氏菌檢測

--本卷須知結(jié)果記錄景象察看:菌落特征、革蘭氏染色、BS瓊脂、HE瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂常見問題:SC〔亞硒酸鹽胱氨酸增菌液〕 TTB〔四硫磺酸鈉煌綠增菌液〕 MM亞硒酸鹽抑菌胱氨酸促生長 四硫酸鈉和煌綠抑菌 氯化鎂和孔雀綠抑菌適宜傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長,37℃ 適宜其他沙門菌生長,42℃,18~24h為防漏檢宜SC+TTB/MM沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ(即亞利桑那菌)BS瓊脂產(chǎn)硫化氫菌落為黑色帶有金屬光澤,棕褐色或灰色,菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色;有些菌株不產(chǎn)生硫化氫,形成灰綠色的菌落,周圍培養(yǎng)基不變黑色帶有金屬光澤DHL瓊脂無色半透明,產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖陽性的菌株為粉紅色,中心帶黑色HE瓊脂WS瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色;多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫,菌落中心黑色或幾乎全黑色乳糖陽性的菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色;乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色,中心黑色或幾乎全黑色SS瓊脂無色半透明,產(chǎn)硫化氫菌株,有的菌落中心帶黑色,但不如以上培養(yǎng)基明顯乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖陽性的菌株為粉紅色,中心黑色,但中心無黑色形成時與大腸埃希氏菌不能區(qū)別

第二節(jié)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)技術(shù)

金黃色葡萄球菌近年來,美國疾病控制中心報(bào)告,由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位,僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生問題,在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個細(xì)菌性食物中毒的33%,加拿大那么更多,占45%,我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)金黃色葡萄球葡萄球菌表皮葡萄球菌屬分類:腐生葡萄球菌金黃色葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒。是由于進(jìn)食含有一種或多種含葡萄球菌腸毒素的食物所引起。常見的菌為金黃色葡萄球菌。致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病,可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎病癥,惡心、嘔吐最為突出而且普遍,腹痛、腹瀉次之。當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品,如牛奶和奶制品、肉、蛋等,在溫度條件適宜時,經(jīng)8-10小時即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。雪印牛奶中毒事件2000年6月29日起,日本雪印公司奶粉、低脂肪牛奶、酸奶等3種牛奶制品被查出金黃色葡萄球菌毒素,呵斥1.5萬名消費(fèi)者中毒緣由是在北海道的奶粉消費(fèi)工廠〔該廠的產(chǎn)品都是先制成奶粉,再在各地工廠復(fù)原成牛奶〕出現(xiàn)了停電,使消費(fèi)線上的原料停留過久,所以出現(xiàn)了細(xì)菌超標(biāo)。2001年以后-借助其他公司援助開場分割公司事業(yè)。2002年雪印食品被解散一、生物學(xué)特性革蘭氏陽性需氧或兼性厭氧菌,為球菌,陳列成葡萄狀,無芽孢、鞭毛,不運(yùn)動;大多數(shù)無莢膜。最適生長溫度37℃,最適pH為7.4,對熱抵抗力較強(qiáng),80℃30min才干被殺死??稍?0%-15%氯化鈉和40%膽汁中生長生物學(xué)特性

好氧生長的細(xì)胞產(chǎn)生接觸酶;產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶,大多數(shù)菌株可水解天然的動物蛋白,例如血紅蛋白、纖維蛋白、卵白、酪朊和多肽類如明膠,水解脂類、吐溫類和磷脂蛋白質(zhì),并釋放脂肪酸。一切的毒株產(chǎn)生凝固酶,人和動物來源的菌株通??赡掏谩⑷?、馬和豬的血漿。生物學(xué)特性---培育特征大多數(shù)菌株產(chǎn)生類胡蘿卜素,使細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色,色素的產(chǎn)生取決于生長的條件,而且在單個菌株中能夠也有變化可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反響陽性,VP反響弱陽性。許多菌株可分解精氨酸,水解尿素,復(fù)原硝酸鹽,液化明膠。具有較強(qiáng)的抵抗力,對磺胺類藥物敏感性低,但對青霉素、紅霉素等高度敏感。致病性金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌,臨床表現(xiàn)多種多樣,可引起部分化膿感染,也可引起肺炎、胃腸炎、心包炎等,甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶:a.溶血毒素:外毒素,分甲、乙、丙、丁、戊五種,能損傷血小板,破壞溶酶體,引起肌體部分缺血和壞死;b.殺白細(xì)胞素:可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞;c.血漿凝固酶:侵入人體時,該酶使血液或血漿中的纖維蛋白堆積于菌體外表或凝固,妨礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌構(gòu)成的感染易部分化與此酶有關(guān);d.脫氧核糖核酸酶:產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫,可用來作為根據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌;e.腸毒素:產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素,現(xiàn)已鑒定出葡萄球菌腸毒素有A、B、C1~C3、D、E、G、H共9種。腸毒素A是最常見的。

金黃色葡萄球菌的致病性葡萄球菌皮膚感染食物中毒病癥及發(fā)生緣由:病癥緣由惡心、反復(fù)嘔吐,中上腹部疼痛,伴有頭暈、頭痛,腹瀉、發(fā)冷。嚴(yán)重者可導(dǎo)致大量失水而虛脫。葡萄球菌污染了食品,在適宜的pH值和溫度〔最適范圍內(nèi)〕下大量繁衍,產(chǎn)生腸毒素。二、檢驗(yàn)所需培育基10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯7.5%氯化鈉肉湯血瓊脂平板Baird-Parker瓊脂平板腦心浸出液肉湯(BHI)兔血漿磷酸鹽緩沖液營養(yǎng)瓊脂小斜面革蘭氏染色液無菌生理鹽水三、檢驗(yàn)程序GB4789.10-2021規(guī)范第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn);第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù);第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。第一法檢樣25g樣品+225ml7.5%NaCl肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯血平板36±1℃24hr鏡檢營養(yǎng)肉湯血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果定性檢測36±1℃24hr36±1℃24hr36±1℃6hrBP平板第一法第二法Baird-Parker平板法檢驗(yàn)程序定量檢測〔平板法〕適用于檢測金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g〔mL〕的食品25g樣品+225ml生理鹽水選三個延續(xù)梯度,每個梯度分別取1mL接種之至外表枯燥的BP平板〔如0.4mL,0.3mL,0.3mL〕平板計(jì)數(shù)〔分別記錄每種類型的菌落數(shù)〕36±1℃48hr鏡檢營養(yǎng)肉湯血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果金葡菌數(shù)/g(mL)定量檢測〔平板法〕每種類型至少選取一個菌落36±1℃24hr36±1℃6hr適用于檢測金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g〔mL〕的食品梯度稀釋第三法金黃色葡萄球菌MPN檢驗(yàn)程序定量檢測〔MPN法〕25g樣品+225ml生理鹽水選三個延續(xù)梯度,每個梯度各取3mL參與3管胰酪胨大豆肉湯36±1℃45-48hrBP平板血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)查MPN表定量檢測〔MPN法〕36±1℃45-48h報(bào)告結(jié)果

適用于檢測能夠含有少量金黃色葡萄球菌,卻帶有大量競爭菌的樣品梯度稀釋第三法金黃色葡萄球菌MPN檢驗(yàn)程序金黃色葡萄球菌的檢測--測定方法國標(biāo)方法本卷須知景象察看:染色鏡檢〔形狀、染色〕外表光滑的菌落,菌落色素不穩(wěn)定,但多數(shù)為金黃色。Baird-Parker瓊脂平板〔BP平板〕、血平板、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)多數(shù)產(chǎn)腸毒素的菌株在血瓊脂平板上能構(gòu)成溶血圈,并能產(chǎn)生血漿凝固酶,這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要目的。四、操作方法1.增菌培育法〔1〕檢樣處置將25g〔mL〕檢樣加于225mL滅菌生理鹽水中的滅菌器內(nèi),制成1:10檢樣混懸液?!?〕增菌培育汲取液體檢樣5ml,接種于50mL7.5%氯化鈉肉湯50ml進(jìn)展增菌?!?〕分別培育將上述培育物,分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板。血平板36℃±1℃培育18h~24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培育18h~24h或45h~48h。檢測步驟---增菌利用金黃色葡萄球菌耐鹽的特性〔可耐受15%的氯化鈉〕,用含7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯〔4〕察看菌落形狀Baird-Parker平板、血平板上挑取可疑菌落。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上,菌落直徑為2mm~3mm,顏色呈灰色到黑色,邊緣為淡色,周圍為一混濁帶,在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度,偶爾會遇到非脂肪溶解的類似菌落;但無混濁帶及透明圈。在血平板上,構(gòu)成菌落較大,圓形、光滑凸起、潮濕、金黃色〔有時為白色〕,菌落周圍可見完全透明溶血圈。檢測步驟---分別BP平板:胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素丙酮酸鈉是一種生長促進(jìn)劑亞碲酸鹽對除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性,并使菌落產(chǎn)生黑色卵黃提供營養(yǎng)和有利于察看卵磷脂環(huán)甘氨酸和氯化鋰對金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制造用。Baird-Parker氏培育基-成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰(LiCl·6H2O)5g瓊脂20g蒸餾水950mLPH7.5Baird-Parker氏培育基-增菌劑的配法30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞蹄酸鉀溶液10mL混合,保管于冰箱內(nèi)。Baird-Parker氏培育基-制法將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解。冷至25℃,校正pH。分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂,冷至50℃,每95mL參與預(yù)熱至50℃的卵黃亞蹄酸鉀增菌劑5mL,搖勻后傾注平板。培育基應(yīng)是致密不透明的。運(yùn)用前在冰箱儲存不得超越48h。檢測步驟---分別在BP平板上其典型菌落為:圓形,光滑突起,潮濕,直徑2-3mm,顏色呈灰色到黑玉色,邊緣常為淡色〔米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色〕,周圍為一混濁帶,在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹膠的粘稠感。偶爾會遇到不分解脂肪菌株,除無混濁帶及透明圈外,其他外觀根本一樣。B-P平板Baird-Parker(BP培育基/貝爾德帕克平板)用于凝固酶陽性葡萄球菌的分別和菌落計(jì)數(shù)用。¥7〔90mm)Baird-Parker平板是一種選擇性培育基,在含有氮源的根底上,補(bǔ)充了促進(jìn)細(xì)菌生長的丙酮酸鈉,又含有抑制劑:亞碲酸鉀,故有較好的選擇性。但對于金葡萄球菌沒有抑制,其能將亞碲酸鉀復(fù)原為碲在菌落中心呈黑色,易于察看;參與卵黃,由于卵磷酯酶陽性特征,其菌落周圍可出現(xiàn)一明顯的沉淀環(huán),以資區(qū)別。根據(jù)菌落形狀,作出相應(yīng)的處置或報(bào)告。例如:金黃色葡萄球菌呈圓形、有光澤隆起,中部黑色,邊緣灰色有微透明的渾濁帶;革蘭陽性桿菌呈棕黑色,無光澤有時在培育48h后也出現(xiàn)渾濁帶;酵母菌為白色無透明環(huán)。

血平板:金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素,因此在血平板上產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)。血平板上其典型菌落呈金黃色,有時也為白色,大而突起,圓形,不透明,外表光滑,有溶血圈。血平板〔5〕革蘭氏染色鏡檢〔6〕血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上,分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂斜面,36℃±1℃培育18h~24h。取新穎配置兔血漿0.5mL,放入小試管中,再參與BHI培育物0.2mL~0.3mL,振蕩搖勻,置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi),每半小時察看一次,察看6h,如呈現(xiàn)凝固〔即將試管傾斜或倒置時,呈現(xiàn)凝塊〕或凝固體積大于原體積的一半,被斷定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培育物作為對照。也可用商品化的試劑,按闡明書操作,進(jìn)展血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如可疑,挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI,36℃±1℃培育18h~48h,反復(fù)實(shí)驗(yàn)。檢測步驟--鑒定金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生凝固酶,因此對其鑒別的主要實(shí)驗(yàn)是測定其凝固酶。對于凝固不完全的菌株,可以經(jīng)過一些其他實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步確認(rèn),例如:厭氧葡萄糖發(fā)酵、溶葡萄球菌酶敏感性實(shí)驗(yàn)、耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)等。一切這些實(shí)驗(yàn)不能作為鑒別其產(chǎn)毒與否的根據(jù)。血漿凝固酶實(shí)驗(yàn):汲取1:4新穎兔血漿0.5mL,放入小試管中,再參與培育24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培育物0.5mL,振蕩搖勻,置36±1℃溫箱或水浴內(nèi),每半小時察看一次,察看6h,如呈現(xiàn)凝塊,即將試管倒置或傾斜時,呈現(xiàn)凝塊者,被以為陽性結(jié)果。同時以知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)血漿凝固實(shí)驗(yàn)也可采用玻片法。把兔血漿滴加于載玻片的一端,然后用白金耳挑取菌落與血漿充分混勻、在載玻片另一端以生理鹽水替代血漿做陰性對照。混合后立刻察看,假設(shè)出現(xiàn)凝塊即為陽性。病原性葡萄球菌多數(shù)產(chǎn)生血漿凝固酶,非病原性的普通不產(chǎn)生。因此,該法是斷定葡萄球菌有無致病性的重要目的。血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的原理病原性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶,使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白,附于細(xì)菌外表,生成凝塊,因此具有抗吞噬的作用。凝固酶實(shí)驗(yàn)對于斷定該菌株能否具有致病力,很有協(xié)助。葡萄球菌凝固酶實(shí)驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。葡萄球菌所產(chǎn)生的凝固酶有兩種:結(jié)合凝固酶和游離凝固酶。結(jié)合凝固酶〔即凝聚因子〕:是一種結(jié)合于菌體細(xì)胞壁的酶,它直接作用于血漿中纖維蛋白原,使之變成纖維蛋白,而使葡萄球菌凝集成塊,玻片法陽性結(jié)果是由此酶〔凝聚因子〕所致。游離凝固酶:是凝血酶原樣物質(zhì),不直接作用于血漿纖維蛋白原上,而被血漿中的致活劑〔即凝固酶致活因子〕激活后,變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì),此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變?yōu)楣虘B(tài)纖維蛋白,從而使血漿凝固。試管法的陽性結(jié)果為此酶所致?!痉椒ā俊?〕玻片法〔2〕試管法【結(jié)果判別】〔1〕玻片法:5~10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性?!?〕試管法:如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。4h后無上述景象出現(xiàn),那么放置過夜后再察看?!具\(yùn)用】本實(shí)驗(yàn)僅用于致病性葡萄球菌的鑒定?!痉椒ā俊?〕玻片法:在1張干凈玻片中央加1滴9g/L氯化鈉(生理鹽水)溶液,用接種環(huán)取待檢培育物與其混合〔設(shè)陽性和陰性對照〕制成菌懸液,假設(shè)經(jīng)10~20s內(nèi)無自凝景象發(fā)生,那么參與兔新穎血漿1環(huán),與菌懸液混合,察看結(jié)果?!?〕試管法:用生理鹽水將新穎兔血漿4倍稀釋,取0.5ml于試管再加0.5ml待測菌濃菌懸液〔需做陽性對照及陰性對照?!?,混勻后置37℃水浴中,每30min察看1次結(jié)果。假設(shè)3小時內(nèi)實(shí)驗(yàn)管和陽性對看管出現(xiàn)凝固,陰性對看管〔即濃菌液管〕不凝固,為陽性;假設(shè)陰性,繼續(xù)察看到24小時,不凝固者為陰性?!窘Y(jié)果判別】〔1〕玻片法:5~10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。〔2〕試管法:如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。4h后無上述景象出現(xiàn),那么放置過夜后再察看?!具\(yùn)用】本實(shí)驗(yàn)僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。【本卷須知】〔1〕玻片法:10秒內(nèi)察看結(jié)果,如超越10秒可出現(xiàn)假陽性,因此必需用試管法驗(yàn)證凝聚因子實(shí)驗(yàn)?!?〕可選擇的玻片凝集實(shí)驗(yàn)法還包括檢測凝集因子和蛋白A的膠乳凝集實(shí)驗(yàn)。但膠乳凝集實(shí)驗(yàn)和玻片凝固酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不完全一致。鑒定金黃色葡萄球菌的特異性和靈敏性均高于傳統(tǒng)的玻片凝固酶實(shí)驗(yàn)。〔3〕試管法:須制備濃重的均勻菌懸液,以便察看結(jié)果。a.試管法葡萄球菌凝固酶實(shí)驗(yàn)陽性者,應(yīng)見到明顯的纖維蛋白凝膠塊,出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固,應(yīng)判為陰性。b.假設(shè)培育時間超越4H,應(yīng)思索以下幾點(diǎn):Ⅰ.延伸培育時間后,有些菌株產(chǎn)生的葡萄球菌激酶〔溶纖維蛋白酶〕,可以裂解凝塊,產(chǎn)生假陰性結(jié)果;Ⅱ.假設(shè)運(yùn)用的血漿不是無菌的〔或部分不是無菌的〕,假陽性和假陰性結(jié)果均有能夠發(fā)生;Ⅲ.所用待測菌不純,延伸培育時間后,污染菌能夠?qū)е录訇栃越Y(jié)果。Ⅳ.所用血漿缺乏纖維蛋白原〔脫纖維血漿〕?!?〕最好用EDTA抗凝的兔血漿,不主張用人的抗凝血,兔血漿凝塊結(jié)實(shí),凝固速度快,優(yōu)于人血漿?!?〕實(shí)驗(yàn)不可在高鹽培育基上的取菌落,由于能夠出現(xiàn)自凝或假陽性?!?〕假設(shè)被檢菌為陳舊的肉湯培育物〔超越18~24H〕,或生長不良,凝固酶活性低的菌株能夠檢測不出來。(7)當(dāng)疑心待測菌是金黃色葡萄球菌時,對玻片凝固酶陰性的結(jié)果應(yīng)做試管法凝固酶實(shí)驗(yàn)確證。玻片法和試管法凝固酶實(shí)驗(yàn)的血漿規(guī)范是:必需含有足夠濃度的凝固酶反響因子和纖維蛋白原,必需無溶纖維蛋白活性和無抑制劑。一、動物學(xué)實(shí)驗(yàn)主要用幼貓和猴。二、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)c毒素作為抗原,可以和特異性抗體發(fā)生結(jié)合性反響,產(chǎn)生可見沉淀用血清學(xué)反響檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌腸毒素方法主要有:免疫瓊脂分散法反向間接血凝實(shí)驗(yàn)免疫熒光法酶聯(lián)免疫吸附法

金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測對分型進(jìn)展簡單的了解。1、血清學(xué)分型:金黃色葡萄球菌水解,獲得兩種抗原成分:蛋白抗原和多糖抗原。蛋白抗原主要為葡萄球菌A蛋白〔SPA),是一種外表抗原,90%以上金黃色葡萄球菌有此抗原,無特異性。多糖抗原為半抗原,有型特異性。2、噬菌體分型。3、根據(jù)腸毒素分型。4、根據(jù)血漿凝固酶分型。金黃色葡萄球菌的抗原構(gòu)造和分型血清學(xué)反響可用于檢測食物、培育物或?yàn)V液等標(biāo)本中的細(xì)菌或腸毒素。血清學(xué)反響不僅簡便快捷,而且能對毒素做出最后定型:①菌體熒光抗體染色法涂片:食品樣品接種于葡萄糖肉湯培育基,37℃培育24~48小時。用接種環(huán)取上述增菌液,涂布于載玻片上??菰铮好恳粋€培育物涂布3~4個點(diǎn),37度培育箱內(nèi)枯燥。固定:將枯燥好的玻片放在克氏固定液中固定3-5分鐘,再將固定的玻片標(biāo)本放入95%酒精中浸泡1分鐘。加抗血清:然后充分枯燥,用接種環(huán)取1環(huán)熒光抗血清悄然加于菌膜上.反響:然后37度培育箱內(nèi)作用30分鐘。沖洗浸泡:取出作好的玻片用0.01mol/LPH7.4PBS液沖洗玻片上熒光血清,最后將標(biāo)本放于95%酒精液中浸泡1分鐘左右取出,用熒光顯微鏡鏡檢。有特異性亮堂熒光的為陽性或者菌量在一個視野中有數(shù)個或十幾個細(xì)菌以上者為陽性。②毒素的檢出金黃色葡萄球菌毒素的檢出有免疫瓊脂分散法、反向間接血凝法,放射免疫測定法、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、A蛋白血凝實(shí)驗(yàn)、核酸探針檢測,乳膠凝集實(shí)驗(yàn)等。3.腸毒素的測定動物實(shí)驗(yàn)可用檢樣稀釋液直接作動物實(shí)驗(yàn)或按以下方法將分別菌株培育制備腸毒素。①腸毒素的制備:腸毒素的制備有固體培育法和液體培育法。②腸毒素測定:注射前應(yīng)先喂給幼貓少量的食物,以便察看反響。取上清液按幼貓?bào)w重每100g1mL的劑量腹腔注射或加大2—3倍量口服。然后仔細(xì)察看,普通攻毒后0.5~2小時內(nèi)幼貓發(fā)生嘔吐、腹瀉、體溫上升、畏寒等病癥,經(jīng)4~5小時后逐漸恢復(fù)。同時實(shí)驗(yàn)時用未接種菌的培育基做同樣處置的陰性對照。

第三節(jié)志賀氏菌檢驗(yàn)技術(shù)志賀氏菌屬〔shigella〕是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌,通稱痢疾桿菌。通常志賀氏桿菌(Bacillus,shigae)僅指I型痢疾志賀氏菌。志賀氏桿菌是日本志賀詰在1898年初次分別得到的,因此而得名。本屬細(xì)菌對理化要素的抵抗力較其他腸道桿菌為弱。對酸敏感,在外界環(huán)境中的抵抗力能以宋內(nèi)氏菌最強(qiáng),福氏菌次之,志賀氏菌最弱。普通56-60℃經(jīng)10分鐘即被殺死。在37℃水中存活20天,在冰塊中存活96天,蠅腸內(nèi)可存活9-10天,對化學(xué)消毒劑敏感,1%石碳酸15-30分鐘死亡。

志賀氏菌屬有四個血清組,即A。B、C、D。(1)A群:又稱痢疾志賀氏菌。不發(fā)酵甘露醇。有12個血清型,其中8型又分為三個亞型?!?〕B群:又稱福氏志賀氏菌。發(fā)酵甘露醇。有15個血清型〔含亞型及變種〕,抗原構(gòu)造復(fù)雜,有群抗原和型抗原。根據(jù)型抗原的不同,分為6型?!?〕C群:又稱鮑氏志賀氏菌。發(fā)酵甘露醇,有18個血清型,各型間無叉反響?!?〕D群:又稱宋內(nèi)氏志賀氏菌。發(fā)酵甘露醇,并緩慢發(fā)酵乳糖,普通需求3~4天。只需一個血清型。引起食物中毒的主要是福氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀菌。一、生物學(xué)特性1.形狀特性本屬細(xì)菌為兩側(cè)平行、末端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌短桿菌。無芽胞,無莢膜,無鞭毛。多數(shù)有菌毛。與腸桿菌科各屬細(xì)菌的主要區(qū)別為不運(yùn)動。分解葡萄糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。大多數(shù)不發(fā)酵乳糖。vp實(shí)驗(yàn)陰性,不分解尿素,不構(gòu)成硫化氫,不能利用枸櫞酸鹽作為碳源。2.培育特性1)需氧或兼性厭氧,但厭氧時生長不很旺盛。2)對營養(yǎng)要求不高,在普通瓊脂培育基上易于生長。3)在10℃-40℃范圍內(nèi)可生長。最適溫度為37℃左右。最適pH值為7.2。4〕在固體培育基上,培育18-24小時后,構(gòu)成圓形、隆起、透明,直徑2-3mm、外表光滑、潮濕、邊緣整齊的菌落。3.生化特性注:+:陽性;-陰性;-/+多數(shù)陰性,少數(shù)陽性;〔+〕緩慢陽性;d有不同生化型。福氏志賀氏6型生化特性與A群和C群類似。生化群5%乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基質(zhì)A群:痢疾志賀氏菌---(+)-/+B群:福氏志賀氏菌-++--/+C群:鮑氏志賀氏菌-+-(+)-/+D群:宋內(nèi)氏志賀氏菌+/(+)++d-4.血清學(xué)特性

利用O抗原的復(fù)雜性可將志賀氏菌分成A、B、C、D四群,每一群又可利用O抗原進(jìn)展分型。志賀氏菌四個亞群各具有不同的抗原構(gòu)造,都是由菌體抗原(O)及外表抗原(K)所組成。

二、檢驗(yàn)所需器材檢樣25g〔或25mL〕樣品+志賀氏菌增菌肉湯225mL41.5℃±1℃,16h~20h厭氧培育XLDMAC或志賀氏菌顯色培育基36℃±1℃,20h~48h挑取可疑菌落

TSI,半固體,營養(yǎng)瓊脂斜面

血清學(xué)分型生化鑒定

志賀氏菌屬分群及分型結(jié)果報(bào)告三、檢驗(yàn)程序GB4789.5-2021志賀氏菌檢驗(yàn)程序四、操作方法

1.增菌2.分別3.初步生化實(shí)驗(yàn)4.生化實(shí)驗(yàn)及附加生化實(shí)驗(yàn)5.血清學(xué)鑒定1.增菌以無菌操作取檢樣25g〔mL〕,參與裝有滅菌225mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯,用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min-10000r/min均質(zhì);均質(zhì)袋用拍擊式均質(zhì)器延續(xù)均質(zhì)1min-2min,液體樣品振蕩混勻即可。于41.5℃±1℃,厭氧培育16h-20h。2.分別取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培育基平板上,于36℃±1℃培育20h-24h,察看各個平板上生長的菌落形狀。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個菌落直徑大于其他志賀氏菌。假設(shè)出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易察看,那么繼續(xù)培育至48h再進(jìn)展察看。志賀氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板志賀氏菌的菌落特征MAC瓊脂無色至淺粉紅色,半透明、光滑、潮濕、圓形、邊緣整齊或不齊XLD瓊脂粉紅色至無色,半透明、光滑、潮濕、圓形、邊緣整齊或不齊

3.初步生化實(shí)驗(yàn)挑取平板上的可疑菌落;接種三糖鐵和營養(yǎng)瓊脂斜面和半固體培育基各1管。志賀氏菌在三糖鐵培育基中表現(xiàn)為底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣,斜面產(chǎn)堿,不產(chǎn)H2S。無動力,固體管內(nèi)沿穿刺線生長。4.生化實(shí)驗(yàn)β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解實(shí)驗(yàn)。必要時還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油實(shí)驗(yàn),也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶實(shí)驗(yàn)。生化反響不符合的菌株,即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集,仍不得斷定為志賀氏菌屬。表2志賀氏菌屬四個群4.生化實(shí)驗(yàn)β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解實(shí)驗(yàn)。除宋內(nèi)氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌13型的鳥氨酸陽性;宋內(nèi)氏菌和痢疾志賀氏菌1型,鮑氏志賀氏菌13型的β-半乳糖苷酶為陽性以外,其他生化實(shí)驗(yàn)志賀氏菌屬的培育物均為陰性結(jié)果。另外由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌類似,必要時還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油實(shí)驗(yàn),也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶實(shí)驗(yàn),應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反響不符合的菌株,即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集,仍不得斷定為志賀氏菌屬。表2志賀氏菌屬四個群5.血清學(xué)實(shí)驗(yàn)挑取三糖鐵瓊脂上的培育物,做玻片凝集實(shí)驗(yàn)。先用四種志賀氏菌多價(jià)血清檢查。P166表6-8福氏志賀氏菌各型和亞型抗原和群抗原表6-9志賀氏菌屬四個群的生化特征5、快速診斷法1.熒光菌球法:適于檢查急性菌痢的糞便標(biāo)本。將標(biāo)本接種于含有熒光素標(biāo)志的志賀氏菌免疫血清液體培育基中,37℃培育4~8小時。如標(biāo)本中有相應(yīng)型別的痢疾桿菌,繁衍后與熒光素抗體凝集成小菌球,在低倍或高倍熒光顯微鏡下易于檢出。方法簡便、快速,有一定的特異性。2.協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn):用志賀氏菌的lgG抗體與富含A蛋白的葡萄球菌結(jié)合,以此為試劑,測定患者糞便濾液中志賀氏菌的可溶性抗原。第四節(jié)肉毒梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn)技術(shù)一、生物學(xué)特性1.肉毒梭菌肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌,構(gòu)成芽孢,比菌體寬,呈梭狀,為革蘭氏陽性粗大桿菌,兩端鈍圓,無莢膜,周身有4~8根鞭毛,能運(yùn)動。28~37℃生長良好,最適pH6~8,當(dāng)pH值低于4.5或大于9.0時,或當(dāng)環(huán)境溫度低于15℃或高于55℃時,肉毒梭菌芽孢不能繁衍,也不產(chǎn)生毒素。肉毒梭菌加熱80℃,30min或100℃10min即可殺死。但其芽孢抵抗力強(qiáng),煮沸后要6h,105℃2h,110℃36min,120℃4-5min才干將其殺死。肉毒梭菌生命力很強(qiáng),并廣泛存在于自然界,特別是土壤中,易污染食品,于適宜條件下可在食品中產(chǎn)生猛烈的肉神經(jīng)毒素〔又稱肉毒毒素〕,能引起以神經(jīng)麻木為主要病癥且死亡率極高的食物中毒。肉毒素是目前所知的最劇烈的細(xì)菌外毒素。故肉毒梭菌的檢驗(yàn)?zāi)康闹饕瞧涠舅?。均以毒素的檢測及定型實(shí)驗(yàn)為斷定的主要根據(jù)。引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭

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