第二章 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

第二章微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、接種、分別純化和培育技術(shù)二、形狀構(gòu)造和培育特性察看三、生理生化實(shí)驗(yàn)四、血清學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié)微生物檢驗(yàn)根本知識(shí)一接種將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁衍的人工培育基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。

１接種工具和方法接種和分別工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：１〕劃線接種這是最常用的接種方法。即在固體培育基外表作來(lái)回直線形的挪動(dòng)，就可到達(dá)接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。２〕三點(diǎn)接種在研討霉菌形狀時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板外表上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立構(gòu)成菌落后，來(lái)察看、研討它們的形狀。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)展接種的。３〕穿刺接種在保藏厭氧菌種或研討微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培育基普通是半固體培育基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培育基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，那么在穿刺線周圍可以生長(zhǎng)。４〕澆混接種該法是將待接的微生物先放入培育皿中，然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培育基，迅速悄然搖勻，這樣菌液就到達(dá)稀釋的目的。待平板凝固之后，置適宜溫度下培育，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。５〕涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在外表作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。６〕液體接種從固體培育基中將菌洗下，倒入液體培育基中，或者從液體培育物鐘，用移液管將菌液接至液體培育基中，或從液體培育物中將菌液移至固體培育基中，都可稱為液體接種。

７〕注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。８〕活體接種活體接種是專門用于培育病毒或其它病原微生物的一種方法，由于病毒必需接種于活的生物體內(nèi)才干生長(zhǎng)繁衍。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。２無(wú)菌操作培育基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具〔如接種針和吸管等〕在無(wú)菌條件下接種含菌資料〔如樣品、菌苔或菌懸液等〕于培育基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必需是無(wú)菌操作。斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞二分別純化含有一種以上的微生物培育物稱為混和培育物〔Mixedculture〕。假設(shè)在一個(gè)菌落中一切細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培育〔Pureculture〕。在進(jìn)展菌種鑒定時(shí)，所用的微生物普通均要求為純的培育物。得到純培育的過(guò)程稱為分別純化，方法有許多種。1稀釋平板法〔傾注法和涂布法〕2劃線法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法3富集培育法富集培育法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以發(fā)明一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需求的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)展競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)才干方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越其他微生物。假設(shè)要分別一些專性寄生菌，就必需把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。4厭氧法石蠟法：厭氧培育箱法:亨蓋特滾管法：三培育1、根據(jù)培育時(shí)能否需求氧氣，可分為好氧培育和厭氧培育兩大類。２、根據(jù)培育基的物理形狀，可分為固體培育和液體培育兩大類。第二節(jié)微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一形狀構(gòu)造和培育特性察看１、微生物的形狀構(gòu)造察看主要是經(jīng)過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其外形、大小、陳列方式、細(xì)胞構(gòu)造〔包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等〕及染色特性進(jìn)展察看，直觀地了解細(xì)菌在形狀構(gòu)造上特性，根據(jù)不同微生物在形狀構(gòu)造上的不同到達(dá)區(qū)別、鑒定微生物的目的。２、細(xì)菌細(xì)胞在固體培育基外表構(gòu)成的細(xì)胞群體叫菌落〔colony〕。１〕細(xì)菌的培育特征包括以下內(nèi)容：在固體培育基上，察看菌落大小、形狀、顏色〔色素是水溶性還是脂溶性〕、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起外形、邊緣特征及遷移性等。在液體培育中的外表生長(zhǎng)情況〔菌膜、環(huán)〕混濁度及沉淀等。半固體培育基穿刺接種察看運(yùn)動(dòng)、分散情況。２〕霉菌和酵母菌的培育特征：

大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培育基上構(gòu)成的菌落和細(xì)菌的很類似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培育也和細(xì)菌類似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面構(gòu)成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培育基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培育基外表蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因此菌落邊緣和中心，正面和反面顏色經(jīng)常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培育外表構(gòu)成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。二生理生化實(shí)驗(yàn)微生物生化反響：指用化學(xué)反響來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反響常用來(lái)鑒別一些在形狀和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反響是微生物分類鑒定中的重要根據(jù)之一。１糖酵解實(shí)驗(yàn)不同微生物分解利用糖類的才干有很大差別，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法：以無(wú)菌操作，用接種針或環(huán)移取純培育物少許，接種于發(fā)酵液體培育基管，假設(shè)為半固體培育基，那么用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培育，每天察看結(jié)果，檢視培育基顏色有無(wú)改動(dòng)〔產(chǎn)酸〕，小倒管中有無(wú)氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽(yáng)性，假設(shè)為半固體培育基，那么檢視沿穿刺線和管壁及管底有無(wú)微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無(wú)動(dòng)力，假設(shè)有動(dòng)力、培育物可呈彌散生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵才干，從而進(jìn)展各種細(xì)菌的鑒別，因此每次實(shí)驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。普通常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)等指示劑。２淀粉水解實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)方法：以18~24h的純培育物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板〔一個(gè)平板可分區(qū)接種，實(shí)驗(yàn)數(shù)種培育物〕或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培育24~48h，或于20°培育5天。然后將碘試劑直接滴浸于培育外表，假設(shè)為液體培育物，那么加數(shù)滴碘試劑于試管中。立刻檢視結(jié)果，陽(yáng)性反響〔淀粉被分解〕為瓊脂培育基呈深藍(lán)色、菌落或培育物周圍出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反響那么無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。

留意：淀粉水解系逐漸進(jìn)展的過(guò)程，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的才干、培育時(shí)間，培育基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培育基pH必需為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保管于冰箱，因此以臨用時(shí)制備為妥。３甲基紅〔MethylRedMR〕實(shí)驗(yàn)與V-P(Voger—Proskauer)實(shí)驗(yàn)1)．培育基：緩沖葡萄糖蛋白胨水磷酸氫二鉀5克多胨7克葡萄糖5克蒸餾水1000毫升pH7.0溶化后校正pH，分裝小試管，每管1毫升，高壓滅菌121℃15分鐘。2)．試劑：①甲基紅試劑：甲基紅0.1克，95％酒精300毫升，蒸餾水200毫升。先將甲基紅溶于酒精中，然后參與蒸餾水。②6％a一萘酚酒精溶液，40％氫氧化鉀溶液3)．實(shí)驗(yàn)自瓊脂斜面挑取少量培育物接種于緩沖葡萄塘蛋白胨水中，36士1℃培育2～4天，哈夫尼亞菌那么應(yīng)在22～25℃中培育，進(jìn)展結(jié)果檢查。

4)甲基紅〔MethylRedMR〕實(shí)驗(yàn)與V-P(Voger—Proskauer)實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢查甲基紅(MR)實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锶绱竽c桿菌，志賀氏菌、產(chǎn)氣桿菌等，在糖代謝過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再進(jìn)一步分解生成乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸類添加愈多，那么培育基中的pH值愈下降，當(dāng)降至pH4.5以下時(shí)，甲基紅指示劑呈紅色，即為陽(yáng)性反響，如pH值高于4.5那么培育物呈黃色，即陰性反響。因此，在培育物中參與一滴甲基紅試劑，立刻可察看上述結(jié)果。V—P(Voger—Proskauer)實(shí)驗(yàn)〔丙酮酸〕〔乙酰甲基甲醇〕〔二乙?！?/p>

〔胍〕〔紅色化合物〕VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性〔紅色〕陰性〔不變〕4.明膠液化實(shí)驗(yàn)〔1〕原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培育基成為流動(dòng)的液體?！?〕方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培育基，于22℃培育7d，逐日察看結(jié)果。假設(shè)用35℃孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在察看結(jié)果前，先置4℃冰箱內(nèi)30min，再看結(jié)果?！?〕結(jié)果：培育基呈液化形狀為陽(yáng)性。〔4〕運(yùn)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別，如沙雷菌、普通變形桿菌、奇特變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。5靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)〔色氨酸〕〔靛基質(zhì)〕某些微生物如大腸桿菌、變形桿菌、霍亂弧菌等含有色氨酸酶，能分解培育基中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)(indolo)。當(dāng)它與對(duì)二甲氨基苯甲醛(P—dimethylaminobenaldehyde)作用，構(gòu)成玫瑰靛基質(zhì)(rosindole)而呈紅色。吲哚實(shí)驗(yàn)陰性〔液面黃〕陽(yáng)性〔液面紅〕實(shí)驗(yàn)方法：試劑：L一色氨酸0.1克0.01MpH6.8磷酸緩沖鹽水100毫升儲(chǔ)存于4℃方法：在上述試劑中參與大量純培育菌，使成懸液，置36士l℃水浴中l(wèi)小時(shí)，然后滴加對(duì)二甲基氨基苯甲醛液，察看結(jié)果。結(jié)果：陽(yáng)性者在液面呈粉紅色至玫瑰紅色。

6硫化氫實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸?如沙門氏菌、變形桿菌等)能分解蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸等)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到鉛鹽或鐵鹽，那么發(fā)生作用而生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。COOHCHNH2CH2S·SCH2NH2COOH+4H2→2H2S+2NH3+2CH3COOH+2HCOOHH2S+Pb(CH3COO)2→PbS↓+2CH3COOH(硫化氫)(醋酸鉛)硫化鉛(黑色沉淀)培育基配制及實(shí)驗(yàn)方法見GB4789.28中2.14(微量快速法)：試劑：鹽酸半胱氨酸0.1克0.02MpH7.0磷酸緩沖鹽水100毫升儲(chǔ)存于4℃方法：取上述試劑0.4毫升，挑取一環(huán)純培育物，制成懸液，于管口棉塞間夾一條醋酸鉛試紙(不可接觸試劑)，于36士1℃中每15分鐘察看一次，直至1小時(shí)終了。結(jié)果：試紙條呈棕色至黑色為陽(yáng)性。

7尿素酶實(shí)驗(yàn)?zāi)蛩孛笇?shí)驗(yàn)陰性〔黃〕陽(yáng)性〔紅〕尿素酶實(shí)驗(yàn)陰性〔黃〕陽(yáng)性〔紅〕培育基配制及實(shí)驗(yàn)方法見GB4789.28中2.15(微量快速法)：試劑：尿素10克0.2MpH6.5磷酸緩沖液100毫升0.4％酚紅液取10％尿素液100毫升,參與0.4％酚紅液0.6毫升,于4℃保管,試劑的顏色為黃色，如變成淡紅色，闡明尿素已被分解，不宜運(yùn)用。方法：取一滅菌試管。參與上述試劑0.2毫升，再參與一環(huán)純培育體，于36士1℃培育10~30分鐘察看結(jié)果。結(jié)果：呈淡紅色為陽(yáng)性。8.氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)

〔1〕原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺〔賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺〕和二氧化碳，使培育基變堿。使指示劑顯示出來(lái)?！?〕培育基：氨基酸脫羧酶培育基和氨基酸對(duì)照培育基?！?〕方法：將被檢菌分別接種于賴氨酸〔或鳥氨酸或精氨酸〕培育基和氨基酸對(duì)照培育基中，并參與無(wú)菌液體石蠟或礦物油，于35℃培育1～4d，每日察看結(jié)果?！?〕結(jié)果：對(duì)看管應(yīng)呈黃色，測(cè)定管呈紫色〔指示劑為溴甲酚紫〕為陽(yáng)性，假設(shè)測(cè)定管呈黃色為陰性。假設(shè)對(duì)看管呈現(xiàn)紫色那么實(shí)驗(yàn)無(wú)意義，不能作出判別?！?〕運(yùn)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其他沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽(yáng)性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。

9硝酸鹽復(fù)原實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锶缟抽T氏菌能使硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽，在酸性環(huán)境下，亞硝酸鹽可與氨基苯磺酸結(jié)合成重氮鹽，假設(shè)再遇a一萘胺可構(gòu)成紅色偶氮化合物。培育基及試劑的配制,實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果察看見GB4789.28—2003.2.17試劑；硝酸鈉0.05克溶于0.025MpH6.8磷酸緩沖液中，于4℃保管。方法：取試劑0.2毫升裝一支小試管內(nèi)，取一環(huán)純培育物，制成懸液，置36士1℃培育1小時(shí)，然后參與甲液和乙液各0.2毫升，立刻察看結(jié)果。結(jié)果：陽(yáng)性者呈紅色。10過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锬墚a(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，將過(guò)氧化氫分解而放出氧氣。過(guò)氧化氫酶2H2O2一一→2H20+02↑(氣泡)多數(shù)需氧或兼性厭氧微生物皆能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，而普通厭氧微生物不產(chǎn)生此酶．試劑：3％過(guò)氧化氫溶液方法：取一環(huán)純培育體置于干凈的小試管內(nèi)，滴加3％過(guò)氧化氫液2毫升，30秒鐘內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。11氧化酶實(shí)驗(yàn)〔1〕原理：氧化酶〔細(xì)胞色素氧化酶〕是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物?！?〕試劑：1％鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或1％鹽酸二甲基對(duì)苯二胺。試劑配制及實(shí)驗(yàn)方法見GB4789.28--2021．2.18〔3〕方法：常用方法有三種；1〕菌落法：直接滴加試劑于被檢菌菌落上。2〕濾紙法：取干凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。3〕試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上?！?〕結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色，為陽(yáng)性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照?！?〕運(yùn)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽(yáng)性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽(yáng)性反響。12三糖鐵〔TSI〕瓊脂實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培育物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培育18~24h，察看結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)可同時(shí)察看乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣〔變黃〕；產(chǎn)生硫化氫〔變黑〕。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培育基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧形狀下，酸類不被氧化，所以仍堅(jiān)持黃色。提問(wèn)：志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。應(yīng)該產(chǎn)生什么景象？大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳