植物中超氧化物歧化酶的分離純化

實(shí)驗(yàn)一植物中超氧化物歧化酶(SOD)的分離純化一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^超氧化物歧化酶的分離純化，了解有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)以及纖維素離子交換柱層析方法的原理。掌握測(cè)定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理SOD的性質(zhì)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)簡(jiǎn)稱SOD，是一種生物活性蛋白質(zhì)，是人體不可缺少、重要的氧自由清除劑，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的以自由基為底物的酶。SOD金屬蛋白酶，對(duì)pH、熱和蛋白酶水解等反應(yīng)比一般酶穩(wěn)定。它廣泛存在于各類生物體內(nèi)，按其所含金屬離子的不同，可分為3種：銅鋅超氧化物歧化酶(Cu?Zn—SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和鐵超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。SOD催化如下反應(yīng)：O2-+Oj+2H+—H202+O2SOD的分離提取蛋白質(zhì)包括酶的分離純化方法很多，主要有：①根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法，蛋白質(zhì)的鹽析、等電點(diǎn)沉淀法、低溫有機(jī)溶劑沉淀法；②根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法，透析與超濾、凝膠過濾法；③根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離，電泳法、離子交換層析法。④根據(jù)配體特異性的分離方法一親和色譜法。1、酶的提取純化：在分離制備時(shí)首先將植物細(xì)胞破碎，用提取液制備粗酶液。經(jīng)加熱變性、有機(jī)溶劑沉淀除去大量雜蛋白，再用DEAE-纖維素柱層析或DEAE-葡聚糖柱層析純化，可得到更純的酶。經(jīng)過以上分離純化步驟后，酶可提純100倍以上。大部分酶都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因此，可采用水溶液提取分離和純化酶。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大,是提取酶最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于酶的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)酶的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使酶變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取酶時(shí)一般采用低溫(5°C以下)操作。由于SOD是金屬酶，其金屬離子對(duì)熱有穩(wěn)定的影響，所以SOD對(duì)熱比較穩(wěn)定?一般情況下,SOD表現(xiàn)出短時(shí)間的耐熱性能，據(jù)資料報(bào)道當(dāng)反應(yīng)溫度為88C,時(shí)間為15-30分鐘時(shí)對(duì)酶活性的影響不大.而一般雜蛋白在55C以上時(shí)就容易變性。因此，采用熱擊變性法對(duì)粗酶進(jìn)行處理以除去一部分雜蛋白。極性有機(jī)溶劑能引起蛋白質(zhì)脫去水化層，并降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒凝集而沉淀。采用這種方法沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，要求在低溫下操作，并且需要盡量縮短處理時(shí)間，避免蛋白質(zhì)變性。為此選用低溫有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)一步純化酶。Cu?Zn-SOD的pI為6.8,將上一步收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸餾水中，在pH7.8的條件下，Cu?Zn—SOD帶負(fù)電，過DEAE—32纖維素陰離子交換柱可得到進(jìn)一步純化。離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽(yáng)離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE-纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。離子交換柱層析基本裝置及操作方法1）柱層析的基本裝置柱層析的基本裝置示意圖如圖3－3所示：DnnnnnnnniA—貯液瓶DnnnnnnnniA—貯液瓶D—攪拌器圖50.1梯度洗脫裝置圖B—混合瓶C—A,B—瓶連通管的活塞E-通嘴活塞 F—層析柱G—自動(dòng)收集器2）柱層析的基本操作柱層析的基本操作包括以下一些步驟：⑴裝柱柱子裝的質(zhì)量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。首先選好柱子，根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長(zhǎng)度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時(shí)將柱子洗滌干凈。將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，加適量lmol/LNaOH溶液，攪勻后放置15min,用G3燒結(jié)漏斗抽濾，水洗至中性，濾餅懸浮于lmol/LHCl溶液中，攪勻后放置lOmin后用Gl燒結(jié)漏斗抽濾，水洗至中性，濾餅再懸浮于1mol/LNaOH溶液中，抽濾，水洗至中性，并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡。最后將濾餅懸浮于層析柱平衡緩沖液中待用。關(guān)閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據(jù)分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2?3cm高的緩沖液，同時(shí)關(guān)閉出水口。（可采用機(jī)械化裝柱法）⑵平衡柱子裝好后，要用用pH7.8，2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液作層析柱平衡液平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時(shí)的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3?5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時(shí)柱子平衡好后，還要進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。⑶加樣加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量，體積應(yīng)低于5%的床體積，對(duì)于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當(dāng)然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗(yàn)后才能決定。應(yīng)注意的是，加樣時(shí)應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保持基質(zhì)表面平坦。⑷洗脫、收集、鑒定洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當(dāng)我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡(jiǎn)單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。簡(jiǎn)單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對(duì)固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時(shí)間間隔（或洗脫體積間隔）也不長(zhǎng)，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應(yīng)采用下面的方法。分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級(jí)洗脫。它主要對(duì)混合物組成簡(jiǎn)單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時(shí)適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等。最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強(qiáng)度梯度。當(dāng)對(duì)所分離的混合物的性質(zhì)了解較少時(shí)，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，但對(duì)性質(zhì)相近的組分分離更為有利。同時(shí)還應(yīng)注意洗脫時(shí)的速率。前面我們已經(jīng)談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實(shí)上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時(shí)間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢將增大物質(zhì)的擴(kuò)散，同樣達(dá)不到理想的分離效果。只有多次試驗(yàn)才會(huì)得到合適的流速。總之，我們必須經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)與調(diào)整（可以用正交試驗(yàn)或優(yōu)選法），才能得到最佳的洗脫條件。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，在整個(gè)洗脫過程中，千萬(wàn)不能干柱，否則分離純化將會(huì)前功盡棄。在生化實(shí)驗(yàn)中，基本上我們都是采用部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個(gè)純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般lml-5ml/管。如果分離的物質(zhì)性質(zhì)很相近，可低至0.5ml/管。這視具體情況而定。在合并一個(gè)峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。例如，一個(gè)蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對(duì)各管進(jìn)行鑒定。對(duì)于是單條帶的，認(rèn)為已達(dá)電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對(duì)于不同種類的物質(zhì)采用相應(yīng)的鑒定方法，在這里不再敘述。最后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆?。用pH7.8,2.5mmol/L（100mL）—200mmol/L（100mL）的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。流速1mL/min，每管收集3mL。測(cè)定洗脫液的蛋白質(zhì)含量和酶活，并繪制曲線（用紫外分光光度計(jì)測(cè)各管的OD280，OD280數(shù)值高的管進(jìn)行酶活測(cè)定）。⑹基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）的再生許多基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）可以反復(fù)使用多次，而且價(jià)格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用，嚴(yán)禁亂倒亂扔。這也是一個(gè)科研工作者的科學(xué)作風(fēng)問題。2、植物組織SOD活性測(cè)定：超氧化物歧化酶活性測(cè)定的方法有多種，其中以化學(xué)法應(yīng)用O-?最為2普遍?；瘜W(xué)測(cè)定法包括兩個(gè)方面：一方面是產(chǎn)生超氧自由基，如黃嘌吟氧化酶起作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生O-，腎上腺素自氧化和鄰苯三酚在堿性條件下自2100磷酸鹽(mol/L)50管數(shù)圖100磷酸鹽(mol/L)50管數(shù)圖502蛋白含■.酶活性和梯度洗脫液濃度曲線--表示IW活性曲線， 表示洗脫液濃度曲線▲——▲—代表蛋白含16曲線，-氧化都會(huì)產(chǎn)生O-?；另一方面是對(duì)O-?的檢測(cè)，多數(shù)是利用反應(yīng)液中能與O-?起作用，并易于被檢測(cè)的222指示物質(zhì)的濃度變化來測(cè)定SOD活性。常用的方法有：黃嘌吟-黃嘌吟氧化酶-細(xì)胞色素C法，鄰苯三酚自氧化法，超氧化鉀直接滴定法，氯化硝基氮藍(lán)四唑-核黃素法?？刹捎玫{(lán)四唑（NBT）光還原法。在該反應(yīng)系統(tǒng)中，核黃素照光產(chǎn)生02-，NBT在光照下被02-還原為藍(lán)甲月替，產(chǎn)物在560nm下有吸收峰。通過測(cè)定加入酶液后藍(lán)甲月替含量的變化，可計(jì)算出SOD的活性。3、分析方法蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用紫外線吸收法。酶純度用比活力表示。比活力=酶活/蛋白質(zhì)含量。三、設(shè)備高速組織搗拌機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、LD4-40離心機(jī)、酸度計(jì)、恒溫水浴鍋、天平、冷凍離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、微量進(jìn)樣器、自動(dòng)部分收集器、TH-梯度混合器、HL-IS恒流泵、紫外可見分光光度計(jì)、層析柱、光照箱四、材料、試劑1、圓蔥2、 硫酸鈉(1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙酸(0.5%)、乙醇(5%)、乙醚(5%)、、無(wú)水碳酸鈉、NaOH、CuSO4、酒石酸鈉鉀、鎢酸鈉(Na2WO4^2H2O)＞鉬酸鈉(NazMoOf^O)磷酸溶液、濃鹽酸。硫酸鋰、液體溴、NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液、酚酞、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O氯化硝基氮藍(lán)四唑、乙二胺四乙酸二鈉、核黃素、dl-甲硫氨酸、丙酮(0.5%)0.5mmol/LNaCl、1mol/LHCl溶液、lmol/LNaOH溶液3、 溶劑配制50mmol/LPBS溶液(pH=7.8):①取17.9070gNa2HPO4.12H2O定容至1000ml;②取1.9501gNaH2PO4.2H2O定容至250ml.用②滴定①pH至=7.8,即為50mmol/L磷酸緩沖溶液.2.25mmol/LNBT溶液:取0.1840g氯化硝基氮藍(lán)四唑用pH為7.8的50mmol/LPBS溶液定容至100ml.⑶0.003mmol/LEDTA取0.0011g乙二胺四乙酸二鈉用pH為7.8的50mmol/LPBS溶液定容至1000ml.⑷60mmol/L核黃素:取0.0023g核黃素用pH為7.8的50mmol/LPBS溶液定容至100ml.14.5mmol/Ldl-甲硫氨酸:取0.2163gdl-甲硫氨酸用水定容至100ml.1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白:準(zhǔn)確稱取0.05g牛血清蛋白定容至50ml。pH7.8,2.0mmol/L的磷酸鈉緩沖液：A液：2.0mmol/L磷酸鈉(NaH2PO4.H2O0.287g定容至1000ml)B液：2.0mmol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O0.711g定容至1000ml)按表1方法配制不同pH值緩沖溶液，取A液xml和B液yml,稀釋成200ml溶液備用。表1不同pH值緩沖溶液配制pHXmlYml7.88.591.5⑻pH7.8,200mmol/L的磷酸鈉緩沖液：A液：0.2mol/L磷酸鈉（NaH2PO4.H2O28.70g定容至1000ml）B液：0.2mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O71.1g定容至1000ml)按表1方法配制不同pH值緩沖溶液，取A液xml和B液yml,稀釋成200ml溶液備用。表2不同pH值緩沖溶液配制 pH Xml Yml7.8 8.5 91.5五、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶的制備1、粗酶液的提取將圓蔥切至3cm左右見方的小塊,放入高速組織搗拌機(jī)中,搗碎3-5分鐘,以0.5倍的0.5mmol/LNaCl于4°C下浸泡過夜。然后5000轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心，20分鐘，棄去沉淀，留取上清液，即為SOD抽提液?留樣5ml測(cè)定其酶活和蛋白質(zhì)含量。注意：冷凍離心瓶相對(duì)位置應(yīng)配平。2、熱變性將粗酶液在55C下進(jìn)行處理30分鐘，然后高速冷凍離心，5000轉(zhuǎn)/分鐘,20分鐘，棄去沉淀，留取上清液，留樣5ml測(cè)定其酶活和蛋白質(zhì)含量。3、 丙酮分級(jí)沉淀取經(jīng)熱擊處理后的上清液，緩慢加入冷丙酮量為0.4V/V，然后在冰浴條件下攪拌，冰浴2小時(shí)。5000轉(zhuǎn)/分鐘高速冷凍離心，20分鐘，棄去上清夜，沉淀用5倍2.5mmol/L的磷酸緩沖溶液溶解，留樣2ml測(cè)定其酶活和蛋白質(zhì)含量。（此時(shí)去除雜蛋白的效果最好。）4、 DEAE-纖維素柱層析取經(jīng)過丙酮沉淀后溶解的上清夜，稀釋10倍，過DEAE-纖維素柱（2.6mm*40mm）。先用2.5mmol/LpH7.8磷酸緩沖溶液平衡3-4個(gè)床體積，上樣量為1毫升，繼續(xù)用2.5mmol/LPH7.8磷酸緩沖溶液沖洗120ml,然后再分別用2.5-250mmol/L,pH為7.8的磷酸緩沖液梯度洗脫，流速為0.6ml/min,每5分鐘收集一管。紫外監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280nm，然后收集有活性的部分，量取體積，測(cè)定蛋白質(zhì)含量和酶活性。留取少量溶液備用。（二） 酶活性的測(cè)定2.1活性的測(cè)定測(cè)定前在54ml14.5mmol/Ldl-甲硫氨酸中分別加入EDTA,NBT核黃素溶液各2ml混勻，此為反應(yīng)混合液。在盛有3ml反應(yīng)混合液的試管中，加入適量的酶液（以使抑制達(dá)50%左右的酶濃度為佳），混勻后放在透明的試管架上，于光照培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確照光30分鐘，迅速測(cè)定560nm下的光密度，以不加酶液的照光管為對(duì)照，計(jì)算反應(yīng)被抑制的百分比?；蛘甙凑毡?加入試劑量進(jìn)行添加。表1試劑樣管最大光化管對(duì)照管/mldl-甲硫氨酸2.72.72.7EDTA0.10.10.1核黃素0.10.10.1NBT0.10.10.1酶液適量------2.2活力的計(jì)算以能抑制反應(yīng)50%的酶量為一個(gè)SOD酶活單位。其SOD活力可由下式計(jì)算

SOD活力（U/mlSOD活力（U/ml）=反應(yīng)被抑制的百分比xl00%=50%x樣液體積最大光化管-樣品管

最大光化管

50%x樣品體積xl00%蛋白質(zhì)濃度測(cè)定——紫外線吸收法