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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與疾病骨髓間充質(zhì)細(xì)胞干的基本概念定義:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowstromalcells,BMSCS)是一種增殖能力較強(qiáng)的、存在于骨髓非造血組織中的多能干細(xì)胞。BMSCs的作用是參與構(gòu)成造血干細(xì)胞的生存和分化的微環(huán)境,可作為滋養(yǎng)層支

持造血干細(xì)胞生長(zhǎng)以發(fā)揮造血支持作用。現(xiàn)已清楚,BMSCs具有干細(xì)胞的特征,能夠自我更新并有多向分化增殖潛能,可誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞。

可為心肌、骨、軟骨組織等的損傷提供潛在的修復(fù)能力。但與造血干細(xì)胞相比,骨髓中BMSCs的含量并不豐富。分布:BMSCs是一群具有多向分化潛能的廣泛存在于造血系統(tǒng)以及結(jié)締組織中的成體干細(xì)胞.不同時(shí)期的造血器官、卵黃囊、主動(dòng)脈一生殖脊一中腎區(qū)、胎肝、脾等都有MSCs的存在,發(fā)揮支持造血功能。骨髓中存在大量的MSCs,是BMSCs研究的主要來(lái)源。另外。在造血系統(tǒng)以外,從骨滑膜組織、胚胎、成人以及老年人的肌肉、真皮中也可分離得到MSCs。2006年,MiaoZ等研究證實(shí)胎盤(pán)來(lái)源細(xì)胞與MSC8具有相同的多分化潛能、形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞表面抗原,預(yù)測(cè)胎盤(pán)將成為MSCs的重要來(lái)源,但是該類(lèi)細(xì)胞取材相對(duì)困難,并且面臨著倫理學(xué)方面的問(wèn)題。BMSC的分離培養(yǎng)SD成年鼠脫頸處死,75%乙醇溶液浸泡3min。在無(wú)菌條件下快速去除周?chē)M織,取出股骨。PBS沖洗,剪斷骨兩端,用含培養(yǎng)液的5ml注射器反復(fù)沖洗骨髓腔3次,收集骨髓細(xì)胞懸液;過(guò)濾,充分分散細(xì)胞,接種在培養(yǎng)瓶中,置二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。第5天半量換液,以后每3天全量換液1次。10~14d細(xì)胞接近

融合完成原代培養(yǎng)。隨后進(jìn)行純化培養(yǎng):棄培養(yǎng)液,用PBS輕洗3次,加入0.125%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)37℃,消化3min,直接加入含血清的新鮮培養(yǎng)液終止胰蛋白酶作用。輕輕吹打瓶底液體懸浮BMSC,收集細(xì)胞懸液,1000g離心10min。棄上清后用新鮮培養(yǎng)液重懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2×105細(xì)胞/ml

接種到新瓶[以1∶(2~3)接種到新瓶]。同上方法傳5代至細(xì)胞純度較高可用。取少量細(xì)胞用CD44抗體按免疫組化兩步法進(jìn)行免疫組化鑒定。BMSCs的識(shí)別和鑒定

由于尚未找到BMSCS特異性的標(biāo)記物,通常以其較強(qiáng)的貼壁生長(zhǎng)特性、不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物(如CD14、CD34、CD45等)、形態(tài)似成纖維樣細(xì)胞、具有多向分化潛能等特征來(lái)辨認(rèn)。梭形、纖維樣細(xì)胞原代:克隆樣生長(zhǎng)傳代后:均質(zhì)、旋渦狀排列HumanDogMonkeyMouseRatRabbit形態(tài)學(xué)表面抗原(流式鑒定)名稱(chēng)CD14CD45CD44CD29CD105檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%結(jié)論陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性1.人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞

2.小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞名稱(chēng)CD117CD34CD44CD29Sca-1檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)≤5%≥70%≥70%≥70%≥70%結(jié)論陰性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性名稱(chēng)CD34CD45CD11bCD44CD29CD90檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)≤5%≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%結(jié)論陰性陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性

3.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞

4.大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞名稱(chēng)CD34CD45CD11bCD106CD44CD29CD90檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)≤5%≤5%≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%結(jié)論陰性陰性陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)形態(tài)24h后就見(jiàn)有細(xì)胞貼壁,多數(shù)細(xì)胞呈圓形

(圖1A)72h后首次半量換液去除未貼壁細(xì)胞,此時(shí)貼壁的細(xì)胞為單個(gè),形態(tài)大部分為圓形(圖1B)

圖1.倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)觀察

Fig.1MorphologyofBMSCsinprimarycultureunderaninvertedmicroscope(A)1d,×100;(B)3d,×100;(C)5d,×200;(D)7d,×200;(E)9d,×400;(F)13d,×400.

第1次換液后5~7d可見(jiàn)由幾十個(gè)到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的集落,細(xì)胞形梭態(tài)呈形、三角形或星形(圖1C、D)圖1.倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)觀察

Fig.1MorphologyofBMSCsinprimarycultureunderaninvertedmicroscope(A)1d,×100;(B)3d,×100;(C)5d,×200;(D)7d,×200;(E)9d,×400;(F)13d,×400.

原代細(xì)胞培養(yǎng)10d左右,細(xì)胞快速增殖,每個(gè)集落中的細(xì)胞不斷增殖呈長(zhǎng)梭形放射狀排列(圖1E)培養(yǎng)2周左右,每個(gè)小集落形成約數(shù)百致上千個(gè)細(xì)胞的大集落,集落交界處出現(xiàn)重疊、融合

(圖1F)原代小鼠骨髓MSCs的生長(zhǎng)曲線結(jié)果

BMSCs原代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線(圖2),生長(zhǎng)曲線表明BMSCs的增殖能力很強(qiáng),所測(cè)細(xì)胞在開(kāi)始的前4天里生長(zhǎng)緩慢處于潛伏適應(yīng)期,第5天開(kāi)始迅速增長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,到第9天細(xì)胞數(shù)輕度上升,第10天達(dá)到頂點(diǎn),生長(zhǎng)速度減緩進(jìn)入平臺(tái)期。分化能力:BMSCs具有細(xì)胞跨胚層分化的能力,在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,能夠向不同譜系的細(xì)胞分化,如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等近年研究發(fā)現(xiàn),BMSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中還顯示了極其重要的作用。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及特性在體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增BMSCS的方法主要有兩種:1.貼壁篩選法:也稱(chēng)全骨髓法或一步法。根據(jù)BMSCS具有對(duì)塑料組織貼壁生長(zhǎng)的特性對(duì)其進(jìn)行分離。用含培養(yǎng)液的注射器沖洗骨髓腔,制成細(xì)胞懸液或直接將抽取的骨髓加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)換液傳代去除懸浮的造血干細(xì)胞和其他骨髓細(xì)胞而得以純化,常選用第5代的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。

2.密度梯度離心法:人BMSCS的培養(yǎng)常用此法。根據(jù)BMSCs與其它細(xì)胞的密度不同而采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液將其分離出來(lái),即根據(jù)骨髓細(xì)胞比重不同獲取單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。分離液有Percoll和Ficoll,通過(guò)離心獲取單個(gè)核細(xì)胞。3.流式細(xì)胞儀分選法:根據(jù)BMSCs細(xì)胞體積小,相對(duì)缺少顆粒的特性對(duì)其進(jìn)行分選。在培養(yǎng)人BMSCS時(shí),可以將抗凝的人骨髓用等量培養(yǎng)稀釋后,離心去除上層脂肪液或者分離液分離獲取單個(gè)核細(xì)胞。另外,可通過(guò)差速貼壁或免疫磁珠等方法來(lái)分選純度更高、更均一的BMSCs上述方法雖各有優(yōu)缺點(diǎn),但由于BMSCs數(shù)目少,在104~105個(gè)單核細(xì)胞中僅有1個(gè)

BMSCS,而且MSCS無(wú)特異性標(biāo)記物,分離純化較為困難。因此,有待進(jìn)一步研究一種簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)的分離方法。BMSCS的抗原表型不特異,表達(dá)有內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等其他細(xì)胞的表面抗原。常用于篩選骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原有SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等。BMSCS的培養(yǎng)液選用添加10%胎牛血清的低糖DMEM,其他可選用的培養(yǎng)基還有α-MEM、IMDM、PRMI1640等。在體外培養(yǎng)BMSCS至25代時(shí),其表型、核型及分化潛能沒(méi)有明顯的改變。骨髓干細(xì)胞的多向分化潛能BMSCS一方面是造血誘導(dǎo)微環(huán)境的重要成員,另一方面在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下,BMSCS可以分化分化為中胚層的組織細(xì)胞,甚至跨越胚層,向外胚層及內(nèi)胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化,其中包括成骨細(xì)胞和軟骨、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞和肝細(xì)胞等。在BMSCS體外誘導(dǎo)分化中,成骨細(xì)胞是報(bào)道最多的一種,在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均得到肯定。已證明可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的因子有地塞米松、β-磷酸甘油、維生素C、1,25-(OH)2-維生素D3、IL-6、IL-11、透明質(zhì)酸、銅、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白及其他因子,如bFGF、TGF-β、BMP等。誘導(dǎo)得到的成骨細(xì)胞可通過(guò)測(cè)定纖維粘連蛋白、I型膠原、骨鈣素、鈣結(jié)晶、堿性磷酸酶等來(lái)鑒定。在無(wú)血清的培養(yǎng)基中單獨(dú)或聯(lián)合添加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1,3(TGF-β1,3)、骨形態(tài)蛋白(BMP)、丙酮酸鈉、甲狀腺素、胰島素、地塞米松、脯氨酸、牛胰島素、干擾素、亞硒酸、亞油酸、牛血清白蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ等可誘導(dǎo)BMSCS分化為軟骨細(xì)胞,Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白合成增加。地塞米松、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、胰島素、茚甲新、吲哚美辛、泌乳素等能誘導(dǎo)BMSCS分化為脂肪細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集含脂質(zhì)豐富的小泡。可用油紅染色辨認(rèn)。BMSCS分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的潛能在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化。此外,BMSCS還可以在不同條件下在體外被誘導(dǎo)為肌腱組織,肌組織,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,表皮細(xì)胞,上皮樣細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞等。BMSCS還具有在一定條件下促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和分化的作用。BMSCS還參與調(diào)節(jié)機(jī)體功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用BMSCS在細(xì)胞替代、基因治療以及組織器官的再造中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。骨髓采集方便、安全、損傷小,供者無(wú)明顯并發(fā)癥,有利于體外擴(kuò)增和自體回植,因此BMSCS可以成為組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源。BMSCS的定向分化可作為探討細(xì)胞分化基制的模型。神經(jīng)細(xì)胞方面的分化研究:體內(nèi)外誘導(dǎo)BMSCs可以變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞。2000年Brazehon等證實(shí)小鼠

BMSCs在腦內(nèi)可分化為神經(jīng)細(xì)胞,并且可遷移分布到各個(gè)腦區(qū)。這一研究為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Zhao等在2002年證實(shí)把成人的BMSCs移植入中風(fēng)模型的大鼠腦內(nèi),結(jié)果顯示在不同的神經(jīng)測(cè)試中受體鼠都比其他鼠表現(xiàn)良好。Kohyama等報(bào)道經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化BMSCs可成為具有成熟功能的神經(jīng)細(xì)胞,為自體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。Mezey等報(bào)道在腦組織切片中發(fā)現(xiàn)來(lái)源于BMSCs的神經(jīng)細(xì)胞。Kawada等研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在受體體內(nèi)能夠遷移,同時(shí)在發(fā)生心肌梗死后可以分化為心肌細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)臈l件下,BMSCS可以分化為三個(gè)胚層來(lái)源的組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植的治療。BMSCS在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后,可以直接進(jìn)行細(xì)胞移植或種植于生物材料上,回植入機(jī)體修復(fù)組織缺損。另外,無(wú)論是反轉(zhuǎn)錄病毒載體還是腺病毒載體均可攜帶目的基因成功轉(zhuǎn)染BMSCS,并在體內(nèi)高效表達(dá)。對(duì)于如何定向誘導(dǎo)BMSCS向單一的特定組織細(xì)胞分化是當(dāng)前研究得焦點(diǎn),它不僅為臨床應(yīng)用,而且為研究BMSCS的跨胚層分化的規(guī)律及闡明基因調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用脊髓損傷的治療:將BMSC移植進(jìn)大鼠挫傷脊髓來(lái)研究BMSC移植后的情況和對(duì)截癱動(dòng)物的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSC在脊髓損傷中心形成細(xì)胞橋并促進(jìn)脊髓神經(jīng)元存活,和動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能改善(Hofstetteretal,2002)。創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的治療將BMSC直接注入TBI鼠的腦內(nèi),其在腦內(nèi)表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物,而且促進(jìn)鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而,移植的BMSC僅局限于移植部位附近1mm處。Mahmood將雄鼠MSCs通過(guò)尾靜脈注入TBI雌鼠中,15天后注射組與對(duì)照組相比,神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)功能損傷明顯降低;損傷側(cè)MSCs細(xì)胞明顯多于對(duì)側(cè),一些細(xì)胞表達(dá)了NeuN和GFAP;未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。Mahmood等研究發(fā)現(xiàn),BMSCs移植進(jìn)入急性腦損傷的大腦半球后,腦損傷大鼠的神經(jīng)功能明顯改善。帕金森病的治療:Li等將BMSCs注入帕金森病小鼠模型的紋狀體中,35天后發(fā)現(xiàn)移植小鼠的旋轉(zhuǎn)行為明顯改善(Lietal,2000)?;蛑委煟篠chwarze向MSCs轉(zhuǎn)染TH基因和GTP基因,MSCs在體內(nèi)和體外都能分泌L-Dopa;轉(zhuǎn)基因的,MSCs還保持著它的多潛能性;將轉(zhuǎn)基因的,MSCs細(xì)胞注入6一羥多巴帕金森病鼠模型的紋狀體內(nèi),MSCs在體內(nèi)至少存活87天;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)明顯減輕;然而,轉(zhuǎn)基因的表達(dá)在第9天停止。

體外共培養(yǎng)研究:新近的研究還證明,BMSCs可以促進(jìn)與之共培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化(Wuetal,2003)。定向誘導(dǎo)后的移植研究:目前,MSCs移植中所使用的細(xì)胞主要是未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs。Dezaw等發(fā)現(xiàn),先在體外將MSCs誘導(dǎo)為具有Schwann細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)的細(xì)胞,再將其移入截?cái)嗟淖巧窠?jīng)末端,與移植未誘導(dǎo)的的MSCs相比,移植誘導(dǎo)后的MSCs使坐骨神經(jīng)再生更顯著。問(wèn)題與展望近年來(lái)關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)和臨床研究有了較大發(fā)展,但要將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于臨床,仍面臨諸多問(wèn)題:由于對(duì)BMSCs研究方向及分離方法等的差異,同時(shí)對(duì)其

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