酶工程第二章：酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)

第二章酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)

提取分離法微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶酶的生產(chǎn)方法生物合成法

植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶化學(xué)合成法動物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶

第一節(jié)酶生物合成及調(diào)節(jié)一、酶的生物合成

遺傳信息傳遞的中心法則轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA

核酸是生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者.DNA子代DNA信使RNA蛋白質(zhì)

復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯密碼蛋白質(zhì)生物合成依賴核酸正常功能,核酸生物合成及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)需要蛋白質(zhì)參與.（一）RNA的生物合成--轉(zhuǎn)錄(transcription)定義:以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。遺傳信息:DNA片段中的核苷酸排列順序.分類:mRNAtRNArRNA特點:以DNA雙鏈中的一條鏈的某個片段為模板.有意義鏈:有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的一條DNA鏈.反意義鏈:無轉(zhuǎn)錄功能的一條DNA鏈.轉(zhuǎn)錄模板

啟動子（promoter)

終止子(terminator)模板鏈（templattestrand）

反意義鏈(antisensestrand)有意義鏈(sensestrand)非信息區(qū)DNA5′5′3′3′TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶反意義鏈有意義鏈RNAPPi5’5’5’3’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’RNA的轉(zhuǎn)錄過程(三步)1.起始2.延長3.終止

轉(zhuǎn)錄合成的RNA是rRNA、tRNA、mRNA的前體,還需經(jīng)過加工修飾后才具有生物學(xué)功能.

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（

2

）

起始因子RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點延長階段5

3

RNA

啟動子（promoter)

終止子(terminator)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

離開ThebasicprincipleoftranscriptionRNA鏈的延伸圖解3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位翻譯:以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。mRNA蛋白質(zhì)翻譯

各種信息各種蛋白質(zhì)（核苷酸排列順序）（氨基酸排列順序）（二）蛋白質(zhì)的生物合成--翻譯(translation)

mRNA

是帶有DNA遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接模板。氨基酸密碼

mRNA分子中,每三個相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息,稱為密碼子（codon）或三聯(lián)體密碼。

四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成43個即64個密碼子.其中:1.一個起始密碼:AUG

位于mRNA的5’末端,并兼作蛋氨酸的密碼.2.三個終止密碼:UAAUGAUAG

位于mRNA的3’末端3.多數(shù)氨基酸擁有2-4個密碼.

tRNA

tRNA是氨基酸的轉(zhuǎn)運工具,能攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。

tRNA有特異性,至少有20種以上。每種tRNA的反密碼環(huán)頂端均有由三個核苷酸組成的反密碼,能與mRNA上相應(yīng)的密碼互補(bǔ)結(jié)合(堿基互補(bǔ)配對)。

酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼與反密碼的堿基配對

rRNA

rRNA與蛋白質(zhì)組成核蛋白體,是蛋白質(zhì)合成的場所.由大小兩個亞基組成:小亞基:與mRNA結(jié)合,沿5’3’

方向移動.大亞基:受位(A位):結(jié)合氨基酰-tRNA給位(P位):成肽AUGACA5’蛋蘇UGUGUU3’受位(A位)給位(P位)大亞基小亞基

蛋白質(zhì)的合成過程

（大腸桿菌）

氨基酸的活化肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈合成的終止與釋放氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運反應(yīng)式：AA+tRNA+ATP氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA+AMP+PPi

對于E.coli而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。核蛋白體循環(huán)（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段肽鏈合成的起始階段1.mRNA與小亞基結(jié)合：形成30S-mRNA-IF3復(fù)合物2.AUG與蛋氨酰-tRNA結(jié)合：

30S-mRNA-IF3

fMet-tRNA-IF2-GTP

fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密碼子上（AUG）。3.大小亞基結(jié)合IF130S起始復(fù)合物AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亞基mRNA蛋氨酰tRNAGTP大亞基GDP+Pi受位給位蛋蛋肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的延伸階段1.進(jìn)位:氨基酰-tRNA進(jìn)入受位;2.轉(zhuǎn)肽:形成肽鍵,在轉(zhuǎn)肽酶作用下,給位與受位結(jié)合;3.移位:核蛋白體向3’端移動一個密碼子的位置,空出受位,不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、移位,使肽鏈延長。AUGACA5’3’UAC蛋蘇UGUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’蛋蘇UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始復(fù)合體進(jìn)位轉(zhuǎn)肽移位Mg+K+肽鏈合成的終止階段1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合;2.肽鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離.

AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’終終AUGUAA5’UAC3’終5’3’UAC終肽鏈肽鏈合成后的“加工處理”N端改造fMet的切除信號肽（signalpeptide）的切除肽鏈中氨基酸殘基的化學(xué)修飾乙?；⒓谆?、磷酸化、糖基化4.切除前體中功能不必需肽段

某些多肽要經(jīng)特殊的酶切一段肽鏈后才有生物活性(如：胰島素)5.肽鏈的折疊6.二硫鍵的形成二、酶生物合成的調(diào)節(jié)

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是酶生物合成中最重要的調(diào)節(jié)，是一種在基因水平上的代謝調(diào)節(jié)。與調(diào)節(jié)酶活性的反饋抑制相比，調(diào)節(jié)酶的合成（即產(chǎn)酶量）而實現(xiàn)代謝調(diào)節(jié)的方式是一類較間接而緩慢的調(diào)節(jié)方式。定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。

操縱子——基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì),struturalgene,S）控制部位操縱基因（operatorgene,O）啟動子（promotorgene,P）（一）基因調(diào)控理論

JacobandMonod的操縱子學(xué)說（operontheory）誘導(dǎo)型操縱子：只有當(dāng)存在誘導(dǎo)物時，轉(zhuǎn)錄頻率才最高

乳糖操縱子阻遏型操縱子:只有當(dāng)缺乏輔阻遏物時,轉(zhuǎn)錄頻率才最高

色氨酸操縱子基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖

調(diào)節(jié)基因

啟動基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因

DNA

轉(zhuǎn)錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉(zhuǎn)錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質(zhì)

誘導(dǎo)劑

控制區(qū)信息區(qū)操縱子

調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)：

可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)

（一種變構(gòu)蛋白），通過與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。

cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖

啟動基因（promotergene）（啟動子）：有兩個位點：

（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。

只有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點上，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點上，酶的合成才能開始。

操縱基因（Operatergene）:

位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（Struturalgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。(二)酶合成調(diào)節(jié)的類型

1.誘導(dǎo)

(induction)

組成酶：細(xì)胞固有的酶類。誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時合成的一類酶。

2.阻遏

(repression)

分解代謝物阻遏(cataboliterepression)

反饋阻遏(feedbackrepression)（三）酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制

1.酶合成的誘導(dǎo)加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進(jìn)行。酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；當(dāng)換成葡萄糖培養(yǎng)基時，三種酶基本消失；（3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時才合成。乳

糖

操

縱

子

的

負(fù)

調(diào)

控調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖

阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo)

2.末端產(chǎn)物阻遏

由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現(xiàn)象：

實驗：

（1）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成。

色氨酸操縱子——酶的阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物調(diào)控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性－＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物－轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比3.分解代謝物阻遏指細(xì)胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：

實驗：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”(diauxie或biphasicgrowth）。

這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。乳糖操縱子的正調(diào)控——分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)三、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選育（一勞永逸）

1.誘變育種

(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型（消除對誘導(dǎo)劑的依賴）

——選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜瓦x育營養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋阻遏選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏——選育抗分解代謝阻遏突變株

2.基因工程育種

（二）條件控制1.添加誘導(dǎo)物

酶的作用底物（或底物前體）

誘導(dǎo)物分三類酶的反應(yīng)產(chǎn)物酶的底物類似物（最有效）2.降低阻遏物濃度

除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏避免培養(yǎng)基過于豐富添加一定量的cAMP3.促進(jìn)分泌（添加表面活性劑）

離子型對細(xì)胞有毒害作用表面活性劑Tween－80

非離子型增加細(xì)胞通透性

TritonX－1004.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑

產(chǎn)酶促進(jìn)劑對不同細(xì)胞、不同酶的作用效果各不相同，需通過試驗選用適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)酶促進(jìn)劑并確定最適濃度。

第二節(jié)酶發(fā)酵動力學(xué)

研究內(nèi)容：研究發(fā)酵過程中細(xì)胞的生長速率，產(chǎn)物的形成速率以及環(huán)境因素對這些速率的影響。即研究生物反應(yīng)速度的規(guī)律。意義：更加深入地認(rèn)識和掌握發(fā)酵過程，為工業(yè)發(fā)酵的模擬、優(yōu)化和控制打下基礎(chǔ)。研究方法：用數(shù)學(xué)模型定量描述。一、細(xì)胞生長動力學(xué)內(nèi)容：研究細(xì)胞生長速率及外界環(huán)境因素對細(xì)胞生長速率影響的規(guī)律。目的：使細(xì)胞生長速度維持在一定范圍內(nèi)，以達(dá)到較為理想的效果。

細(xì)胞生長曲線

O-A延遲期

A-B指數(shù)生長期

B-C減速期

C-D靜止期

D-E衰亡期

在分批培養(yǎng)(batchculture)過程中，細(xì)胞生長一般要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長期、減速期、靜止期和衰亡期5個階段。

營養(yǎng)物濃度（生長限制基質(zhì)濃度）和生長速率之間的動力學(xué)關(guān)系：Monod模型μ:比生長速率（1/h）（specificgrowthrate）即每單位數(shù)量的細(xì)菌或物質(zhì)在單位時間內(nèi)（h）增加的量μmax：最大比生長速率（1/h）S：營養(yǎng)物濃度（生長限制基質(zhì)濃度）克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營養(yǎng)物利用常數(shù)克/L，或mol/LKs是使μ達(dá)到最大比生長率μmax值一半時的營養(yǎng)物濃度（限制基質(zhì)濃度）。當(dāng)

S

Ks時，μ=μmaxS/Ks，μ很小，增加基質(zhì)濃度可明顯提高μ。當(dāng)S=Ks時，μ=0.5μmax，隨營養(yǎng)物濃度增加，μ相應(yīng)增加，逐漸趨向μmax，此時營養(yǎng)物濃度仍是生長的限制因素，在Monod模型上表現(xiàn)為曲線。當(dāng)

S

Ks時，μ

μmax，增加基質(zhì)濃度不能提高μ，即營養(yǎng)物濃度不再影響微生物生長，在Monod曲線上表現(xiàn)為直線。在分批培養(yǎng)時，Ks表示微生物對營養(yǎng)物的親和力：Ks越小，親和力越大;Ks越大，親和力越小。

一些微生物的μmax和Monod飽和常數(shù)微生物生長限制基質(zhì)μmaxKsE.Coli葡萄糖0.852.0-4.0E.Coli乳糖20釀酒酵母葡萄糖0.1325木霉菌葡萄糖0.1343.2產(chǎn)脘假絲酵母氧0.440.03產(chǎn)脘假絲酵母甘油4.5

二、產(chǎn)酶動力學(xué)

（一）酶生物合成的模式

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為3種模式，即：同步合成型生長偶聯(lián)型——

中期合成型部分生長偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長偶聯(lián)型——

滯后合成型1.生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型）

酶的生物合成與細(xì)胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。生長偶聯(lián)型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在細(xì)胞生長一段時間后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產(chǎn)物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。

所對應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

2.部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）

酶的合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。特點：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。所對應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線3.非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）

只有當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線

總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素高：可在細(xì)胞停止生長后繼

1）mRNA的穩(wěn)定性續(xù)合成酶差：隨著細(xì)胞停止生長而終止酶的合成2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長而開始酶的合成。受阻遏：細(xì)胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始合成。

酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。對于：同步合成型：提高對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。(二)產(chǎn)酶動力學(xué)一般產(chǎn)酶動力學(xué)方程可表達(dá)為：式中X——細(xì)胞濃度(g/L)

——細(xì)胞比生長速率(h-1)

——生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)

——非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh))E——酶濃度(IU/L)t——時間(h)生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型

非生長偶聯(lián)型

第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶概念：利用微生物的生命活動獲得所需酶的技術(shù)過程。現(xiàn)狀：大多數(shù)酶采用微生物細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。原因：微生物研究歷史長，且具有種類多、易培養(yǎng)、代謝能力強(qiáng)等特點。

已發(fā)現(xiàn)的酶近3000種應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥、遺傳工程、分析研究領(lǐng)域的酶有2500種工業(yè)生產(chǎn)商品酶50-60種大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的有10多種研究用商品酶300-400種一、產(chǎn)酶微生物的分離和選育1.產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件（優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的標(biāo)準(zhǔn)）（1）酶產(chǎn)量高（2）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低）（3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化（4）易分離提純（5）安全可靠（不是致病菌）2.常用的產(chǎn)酶微生物EscherichiacoliPseudomonasBacillussubtilis

MicrococcusStreptococcusStreptomycesAspergillus

nigerAspergillus

oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma

Rhizopus

Mucor

Absidia

Saccharomyces

cerevisiae

Candida3.微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法固體培養(yǎng):特別適合于霉菌培養(yǎng)液體培養(yǎng):目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式固定化細(xì)胞:需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器

細(xì)菌

-淀粉酶的生產(chǎn)（液體深層發(fā)酵）工藝流程：斜面菌種

孢子懸液

種子擴(kuò)大培養(yǎng)

罐發(fā)酵

熱處理

鹽析

壓濾

干燥

粉碎

成品霉菌

-淀粉酶的生產(chǎn)（固體曲）工藝流程：斜面菌種

三角瓶菌種

種曲

厚層通風(fēng)培養(yǎng)

粉碎

抽提

過濾

沉淀

壓濾

烘干等4.微生物酶的類型（1）胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。（2）胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。

5.產(chǎn)酶微生物的分離和篩選

1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品

2)富集培養(yǎng):投其所好，取其所抗添加特殊的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿性控制培養(yǎng)溫度和熱處理添加抑制劑

3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pureculture）。

4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。

5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。酶活測定方法的建立尤其重要。

-淀粉酶的篩選蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基6.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育誘變育種原生質(zhì)體融合育種基因工程育種酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程

三、發(fā)酵工藝條件及其控制

1.細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

2.培養(yǎng)基的配制

3.pH值的調(diào)節(jié)控制

4.溫度的調(diào)節(jié)控制

5.溶解氧的調(diào)節(jié)控制

在影響的諸多因素中，營養(yǎng)條件最為重要

1）營養(yǎng)物種類：要考慮碳源對酶生物合成的調(diào)節(jié)作用，如產(chǎn)生誘導(dǎo)作用還是分解代謝物阻遏作用。

2）營養(yǎng)物比例：

C/N比不當(dāng),影響菌體對按比例吸收營養(yǎng)物

改變原來合適的pH環(huán)境

氮源不足，表現(xiàn)為菌體繁殖慢;

碳源不足，表現(xiàn)為菌體容易衰老;3）營養(yǎng)物濃度：對易被吸收的限制性營養(yǎng)物濃度控制為充足而不過大。第四節(jié)動、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶與微生物細(xì)胞相比，動物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。

動物細(xì)胞模式圖植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)

植物、動物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動物細(xì)胞細(xì)胞大小/um200～3001～1010～100倍增時間/h﹥120.3-6﹥15營養(yǎng)要求簡單簡單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞>動物細(xì)胞>微生物細(xì)胞。動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細(xì)胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。植物細(xì)胞和動物細(xì)胞對剪切力敏感。植物細(xì)胞、微生物和動物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

1.植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點

以往提取法的缺點：

①提取工藝復(fù)雜；

②植物的栽培和生長受地理環(huán)境和氣候條件的影響；

③易破壞野生植物資源，影響生態(tài)環(huán)境。利用植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)點：

①提高產(chǎn)率、縮短周期。

②易于管理，減輕勞動強(qiáng)度。

③提高產(chǎn)品質(zhì)量。2.培養(yǎng)基植物細(xì)胞培養(yǎng)基與微生物培養(yǎng)基的不同點在于：（1）植物細(xì)胞的生長代謝需要大量的無機(jī)鹽。包括N、P、K、Ca、Mg、S等6種大量元素，F(xiàn)e、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種微量元素。（2）植物細(xì)胞需要多種維生素和植物生長素，如硫胺素、吡哆素、煙酸、肌醇、生長素、分裂素等。（3）植物細(xì)胞要求的氮源一般為無機(jī)氮源。（4）植物細(xì)胞一般以蔗糖為碳源。應(yīng)用最廣的是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基是1962年由Murashinge和Skoog為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計的培養(yǎng)基。LS培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而來的。組分MS培養(yǎng)基（ml/L）碳源大量元素微量元素鐵鹽維生素pH值蔗糖30g/LMS1100MS210MFe液10MB＋液105.7MS培養(yǎng)基組成3.培養(yǎng)方法植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。與微生物發(fā)酵一樣，包括三個步驟：①細(xì)胞株的建立，包括外植體的選擇與處理，愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織經(jīng)單細(xì)胞分離出的優(yōu)良無性繁殖系，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)所得的游離細(xì)胞，供作種子；②擴(kuò)大培養(yǎng)；③大罐培養(yǎng)；有分批培養(yǎng)法、半連續(xù)培養(yǎng)法和連續(xù)培養(yǎng)法。外植體：外植體是從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子等）的片段或小塊。愈傷組織：將上述植外體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25℃左右，培養(yǎng)一段時間，即從外植體的切口部位長出小細(xì)胞團(tuán)，此細(xì)胞團(tuán)稱為愈傷組織。水稻的外植體（幼胚）和愈傷組織外植體愈傷組織4.培養(yǎng)條件的影響與控制（1）溫度：一般控制在室溫范圍（25℃左右）。（2）pH：一般控制在微酸性范圍，即pH5～6。

（3）通氣與攪拌：適當(dāng)。（4）光照的控制：對光照強(qiáng)度、時間、波長有一定的要求。（5）前體的添加（飼喂）：增加次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。（6）誘導(dǎo)子（elicitors）的應(yīng)用：強(qiáng)化次級代謝物的生物合成。5.植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例(1)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)選取結(jié)實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后無菌水漂洗3次。在無菌條件下，切成0.5cm3的小塊，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固體MS培養(yǎng)基中，在25℃，600lux，12h/d光照條件下培養(yǎng)18d，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每18天繼代一次。(2)大蒜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

將上述在半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d的愈傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA（芐基腺嘌呤）

的液體MS培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液體MS培養(yǎng)基中，25℃,600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d。(3)酶的分離純化細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶