DB43-T 2812-2023 普通絲瓜雜交種純度鑒定SSR法技術(shù)規(guī)程

ICS

67.080.20CCS

B31

43

Code

DB

43/T

2812—2023 前言

II1 范圍

12 規(guī)范性引用文件

13 原理

14 主要儀器設(shè)備、試劑耗材

15 試劑配制

26 引物

27 鑒定流程

28 純度計算

3附錄

A（資料性）

5附錄

B（資料性）

7DB

43/T

2812—2023 本文件按照GB/T

1.1—2020

第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。學研究院，湖南湘妹子農(nóng)業(yè)科技有限公司。本文件起草人：韓小霞、胡新軍、閔子揚、李勇奇、鄧穩(wěn)橋、盧亞楠、劉昆言、粟建文。IIDB

43/T

2812—2023

1 范圍計算。本文件適用于普通絲瓜雜交種純度鑒定。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

3543.2

農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程

扦樣3原理SSR標記技術(shù)是一種以特異引物擴增為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)。由于SSR標記廣泛存在于植物基因片段電泳譜帶的差異，可鑒定雜交種純度。4主要儀器設(shè)備、試劑耗材主要儀器設(shè)備0.001片觀察燈、數(shù)碼相機、4

℃冰箱和

-20

℃冰箱。主要試劑Ethylenediaminetetraacetic

acid

disodium

，EDTA-2Na

）、鹽酸（）、氫氧化鈉（NaOH）、三羥甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl)

methyl

，Tris）】、三氯甲烷(Chloroform)Sodium

sulfonate，Isoamyl

alcoholTaq

聚合酶、dNTP

(dATP、、dGTP、dTTP)、引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（N，N，

-methyleme

bisacrylamideTEMEDBoric

Ammonium

persulfateSilver

nitrate冰醋酸（Glacial

acetic

acidSodium

acetate）、甲醛（Formaldehyde）、水（H2O）符合GB-T

6682-2016規(guī)定。主要耗材離心管（

ml、

ml、2.0

ml孔板、96孔PCR擴增板、96孔PCR擴增板管蓋、量筒、發(fā)芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。DB

43/T

2812—20235 試劑配制相關(guān)試劑配制方法見附錄A6 引物部分SSR引物信息見附錄B7 鑒定流程種子催芽種子扦樣參考GB/T

3543.2250102830芽至種子露出子葉。取樣取發(fā)芽種子胚軸

cm～1

cm，用于DNA.DNA

可采用CTAB小樣法或者快速堿煮法提取。7.3.1 CTAB

小樣法

DNA2

ml上放置或者放冰箱冷凍。將研磨好的樣品放置于48孔板架上，60

℃水浴30

，中間每隔5

min搖一次，使樣品受熱均勻。2

mL

0.8

mL氯仿:5

cm～10

min后10,000

5

2

mL離心管，

1室溫靜置3

min，5,000

5

min

用的乙醇洗滌沉淀2入

μL

60

ddH2O，再加入5

μL

RNaseA(10

μg/μl)，37

℃溫浴10

，最后加入1/10的3

mol/L

NaAc及2

℃放置20

min。

5,000

rpm離心5

70%的乙醇洗滌沉淀2次，風干乙醇后加入200

μL

ddH2O。用紫外分光光度計檢測DNA濃度并將DNA溶液用ddH2O稀釋到20

ng/μL，

℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.2快速堿煮法將絲瓜胚軸放入96孔0.25

mol/L的NaOH溶液50

μL96孔板蓋蓋好PCR板，置于沸水中煮3

，最后加入0.1

mol/L的Tris﹒

(pH=8.0)

150

μL。PCR

7.4.1 擴增體系DNA模板約

μL，10×Buffer

1

μL，10

mmol/l

dNTP

0.1

μL，10

pmol/l

0.2

μL，2.5U/μl

rTaq

μL，加滅菌ddH2O10

μL。7.4.2 反應(yīng)程序

????1 ×100%···································································DB

????1 ×100%···································································94

℃預(yù)變性4

，94

℃變性

s，58

℃退火30

s，72

℃延伸30

s，共3072

伸5

min，4℃保存。電泳檢測PCR結(jié)束后，在每孔中加入2

μL

64

℃冰箱待檢測。對于擴增條帶大小差別不大的擴增產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，擴增條帶大小差別較大的擴增產(chǎn)物宜采用普通瓊脂糖凝膠電泳。7.5.1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳裝置準備中，將電泳槽的正極和負極分別與電泳儀連接。 灌膠將現(xiàn)配的8

%丙烯酰胺（）凝膠，輕輕搖勻，緩緩灌入玻璃膠室，膠灌滿整個膠室后，插入樣品梳，室溫下聚合90

min。膠完全聚合后，加入0.5×TBE 點樣與電泳檢測每個PCR擴增產(chǎn)物中加2

μL

63

μL樣品，并設(shè)置標準分子量

V恒壓電泳90

min左右。 染色、顯色和拍照500

ml蒸餾水清洗233

～5

2次～3次。將膠板放入盛有400

mL顯影液的托盤中，輕輕搖動至條帶清晰后，迅速用蒸餾水漂洗3遍～5遍，將膠用保鮮膜包好，置于膠片觀察燈上，觀察帶型并拍照記錄。7.5.2 普通瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物與2

μL

6×加樣緩沖液混合，點樣至

%～3.0

%的瓊脂糖凝膠點樣孔內(nèi)（含有μg/mlDNA1×TAE緩沖液中進行凝膠電泳，電泳電壓

V，電泳時間約30

min擴增條帶。8 純度計算SSR擴增條帶表現(xiàn)雙親帶型，則為雜交種；表現(xiàn)任一親本帶型或者其他帶型，則為假雜種。分別統(tǒng)計雜交種和假雜種的樣品數(shù)量，根據(jù)式計算雜交種純度。????

=

????1?????2式中：????——代表雜交種純度????1——????2——代表非雜交種譜帶類型的個體數(shù)量DB

43/T

2812—2023DB

43/T

2812—2023

附 錄

A（資料性）常用試劑配方A.1DNA

A.1.10.5

mol/L

EDTApH

）溶液稱EDTA

186.1

g，加入已有

ml雙蒸水的燒杯中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH8.0，補雙蒸水至1000ml

ml

20

min4

℃冰箱中保存?zhèn)溆?。A.1.2 1

mol/L

Tris-HCl（三羥基氨基甲烷鹽酸，pH

8.0）溶液稱121.1

g

Tris加入含有

ml雙蒸水的燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1

L，搖勻，4

℃冰箱中保存?zhèn)溆谩.1.3 DNA

提取液取1

mol/L

Tris-HCl溶液50

、0.5

mol/L

20

，稱SDS

7.5

g和氯化鈉

g加入到500

ml燒杯中，用雙蒸水定容至

ml，充分混勻，使得溶液中的最終濃度為Tris?HCl

100

mmol/L，EDTA

mMol/L，NaCl

mmol/L，

1.5

%（A.1.4 氯仿:異戊醇:乙醇（）取

ml三氯甲烷，8

ml異戊醇和32

乙醇加在一起混勻，4

℃冰箱保存?zhèn)溆谩.1.5 0.25

mol/L的

稱取NaOH

，加入雙蒸水定容至

ml。A.1.6 0.1

mol/L的Tris﹒取1

mol/L

Tris-HCl（pH

8.0）10

100

ml。A.2 PCR

PCR擴增所用的，

DNA

℃100

μM10

μl加90

μl10

μM的工作液，

A.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑A.3.1 10×TBE

緩沖液稱取108

g

Tris，55

g硼酸，40

0.5

M

EDTA

8.0)1

L，搖勻。A.3.2 10

%（）稱

g過硫酸銨，加入1

ml雙蒸水，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用（保質(zhì)期48

h）。DB

43/T

2812—2023A.3.31×TBE

緩沖液取

緩沖液200

ml，加雙蒸水1800

A.3.4 1×TAE

緩沖液取

緩沖液200

ml，加雙蒸水1800

A.3.5 6稱取溴酚藍0.25

g，二甲苯青0.25

g98

2

ml

EDTA（pH

）溶液溶解，混勻，-20

A.3.6 8%

PAGE（丙烯酰胺）凝膠40

%

PAGE

8

ml、

4

、ddH20

28

ml、10

%

AP

μl、TEMED

20

μl40

ml，實踐中可根據(jù)垂直板的大小按比例配置凝膠。A.4 銀染、顯影試劑A.4.1 染色液稱

g硝酸銀，加雙蒸水1000

ml溶解，再加

ml甲醛混勻。A.4.2 顯影液稱15

g氫氧化鈉，加入1000

雙蒸水溶解，再加

ml5'-3'3'-5'S01CTCCCTCTTTCCCTCACTCCGACAGGACCGTTAACCCAAAS02TAAATACCCGCCTCGAACACTCCATCCCAGATTTTGCTTCS03GGGAGAACAAGATAGCCCAATGCAAACTTCGATTTGCTCAS04CAGCTCTACAACAACATCTCATCATTGGATGTGGGATTCTCS05AAGATTGAAGTGGGAAAATGCGGCAATCATCTTATCTTTCS06TGGAGTGTTGACATTGTTTTCAGGTTGGAGTAAGCCAAATTACAS07TTGAAGATGAAGCCGGAGTTCTAGAGTCAGATGCCTCGCCS08AGAATAAGGTCCACATAAGGGTTAAAGGCTATGGTATAGAACS09CAGCTCTACAACAACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAACS10ACTCAATCCAACCCACGAATAGTGGCATTTGAACGCTAAGTTGS11TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTS12TTTGAATCTCGCCATGAAGCTACCCTGTTTTGCAGCTACGS13CTCCTCAAGAAAATCCACTTCCCCAGGTAATTCTCCTCCATGTCS14TATTGCCCCAAACTCTTCTCTCATGGACAAAACTTCATAACGCCS15TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTS16TTCCCCATCCATACATTTCTTCCCCTCTCTTCTCCATTTTCTCAS17GGCGGAATACAAGAAAGATACCCATGTGAAAAGGGAACAGAGAAS18CCAACTATCACCCCTACAATCAGGACAGAACCTAAAAGAAAGAAGAGS19GTCTTCCTGAGAGCTTTTGCATCCCTCTTCTCCTTCGATCTTCTS20AACCTCTCGTCATTACTACCGCGTGACTAAAAGCGTGTGAGTGGS21CGTTTGAGATGTGTGCATGTAGTTAAGAGACTGGTTGGAGTTGAGAS22TACCTTCACCCAACTCGCTATTGTGTGTGTTTGATCGGCTGTTS23TTTGTTCTATTCCCCTCTTCCATCGATTACGACGACTTTCTTGAS24TCAGGAAGTGGAGACAACACCGGGAAAAGACTGCACCATCAS25GCTCTCGATTCTAACCAAAACCTCATTCTACCTCTCCAATTCCAS26ACATTTTCACTAGCAGAAGGGGGTGCCCATGTATAGGAAGCAAS27GAAAGAAGGCGAGGAGTGTAGAGAAAAGGAAAGTTGGGGTGTTTS28TTTGGGCTCTGACATTAGATGAACACCTTTGGGAGATAACAAGCS29CTCCAAGGAAGAAGAAGAAACCAATACTGCCACATCATCAGCTCS30GGAGGAGGGAAGAGGAGATGAGGTAAAGCAACAACCCCATAAS31GTCGCCACCGTTGAGTTTAACCTTAATCCGGCTAGGAAAGDB

43/T

2812—2023

附 錄

B（資料性）引物信息表

）公布的信息。表表

引物信息5'-3'3'-5'S32CATCACCACCACCACAACCGCCACCAAAATCAGCTCTATGS33AGAAGTGGGAGATTGAACATGCGTTGGTATGTGAACCTTGAGGCS34TCCACCAACTCTCACTTTCCTTGCATATCCCCAAAACGAACTAAS35AAGACAAATTAAGGAGGGGAGGTAAGACGAGCGTAATGGTTGACS36TTCTTTCTCCTTCGCTGTCTTCGGGATGATGATATTCGGAGCTAS37CCACCCCATTTCATACACAATACATTCAACCTAAGAGCGAGTGAS38AATTTTATGGACCTCATTCCCCTTTA