膠原酶對(duì)大鼠磷脂酶a

膠原酶對(duì)大鼠磷脂酶a

用膠原酶進(jìn)行化學(xué)髓核溶解術(shù)是治療椎間盤突出癥的有效方法，但其具體的治療機(jī)制尚不清楚。研究表明膠原酶是一種膠原蛋白裂解酶,可催化椎間盤髓核中膠原蛋白的裂解。通常認(rèn)為髓核組織的降解和繼發(fā)椎間盤組織再塑型導(dǎo)致神經(jīng)根和馬尾的減壓,從而緩解椎間盤源性神經(jīng)根病的癥狀。影像學(xué)研究表明椎間盤內(nèi)或硬膜外腔注射膠原酶后突出椎間盤的大小和形態(tài)并沒(méi)有迅速改變,但患者常感覺(jué)癥狀在幾天甚至幾小時(shí)內(nèi)消退[2~6],推測(cè)必有其他作用機(jī)制使神經(jīng)根性癥狀相對(duì)迅速緩解。隨著對(duì)腰椎間盤突出致坐骨神經(jīng)痛機(jī)制的深入研究,發(fā)現(xiàn)炎癥因素在坐骨神經(jīng)痛的病理生理過(guò)程中起重要作用。有學(xué)者認(rèn)為,膠原酶除了其髓核溶解作用外,可能具有抗炎癥特性。磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)是一種促炎癥反應(yīng)酶,可能作用于椎間盤源性放射痛的病理生理過(guò)程,改變體內(nèi)神經(jīng)的反應(yīng)性。張紅梅等用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)盡管膠原酶不水解PLA2,但對(duì)PLA2活性具有抑制作用,且隨膠原酶劑量的加大,抑制作用也隨之增強(qiáng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證膠原酶對(duì)PLA2活性的作用,我們運(yùn)用大鼠急性坐骨神經(jīng)痛模型,評(píng)估體內(nèi)膠原酶調(diào)節(jié)促炎癥反應(yīng)酶PLA2的活性的能力以及改善炎癥性神經(jīng)病相關(guān)的行為學(xué)改變的能力。材料和方法一、分組、治療方式及分組雄性Wistar大鼠42只(北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供),體重250~300g。根據(jù)處理方式隨機(jī)分為3組:鹽水治療組、地塞米松治療組、膠原酶治療組。動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)、充足食物和水,在12∶12h晝夜循環(huán)條件下飼養(yǎng)。二、蛋白定量測(cè)定sPLA2檢測(cè)試劑盒(CaymanChemical公司,美國(guó));BCA法蛋白定量試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司,中國(guó));vonFrey刺激纖維(NorthCoastMedical公司,加拿大)。三、模型坐骨神經(jīng)節(jié)段的表達(dá)第0天對(duì)所有42只大鼠行雙側(cè)后肢機(jī)械刺激回縮閾值測(cè)量。建立大鼠急性坐骨神經(jīng)痛模型前從每組隨機(jī)取1只大鼠,共6根坐骨神經(jīng)節(jié)段用于測(cè)量sPLA2基線;其余39只大鼠行手術(shù)建立急性坐骨神經(jīng)痛模型(圖1)。所有動(dòng)物用苯巴比妥鈉(45mg/kg)行腹腔麻醉,無(wú)菌條件下完成手術(shù)操作。模型采用Maves改良的Bennett-Xie模型。每只動(dòng)物采用劈開臀大肌切口暴露右坐骨神經(jīng)三根分叉部近端部分,用4-0鉻腸線在1cm長(zhǎng)的坐骨神經(jīng)節(jié)段上松松結(jié)扎4道,結(jié)扎線須能在暴露的神經(jīng)上自由地滑動(dòng),10倍放大顯微鏡下觀察神經(jīng)外膜血流通暢。運(yùn)用鉻制腸線可以在神經(jīng)周圍和神經(jīng)內(nèi)激發(fā)炎癥反應(yīng),包括神經(jīng)內(nèi)膜水腫、神經(jīng)周圍肉芽腫中充滿炎性細(xì)胞。用小口徑(內(nèi)直徑0.025cm)硅膠管置于結(jié)扎神經(jīng)節(jié)段周圍腔隙,并用彈性硅膠袖套環(huán)繞固定在神經(jīng)周圍。導(dǎo)管近端經(jīng)皮下隧道在頸后另取切口引出,用4-0絲線固定。此導(dǎo)管系統(tǒng)可以保證將藥物精確送到結(jié)扎神經(jīng)周圍。左側(cè)坐骨神經(jīng)按同法暴露,但不結(jié)扎神經(jīng)和置入導(dǎo)管(Sham手術(shù))。切口沖洗后以4-0絲線分2層縫合。第7天對(duì)所有39只大鼠行雙側(cè)后肢機(jī)械刺激回縮閾值測(cè)量后從各組隨機(jī)取出3只大鼠共9只,分別測(cè)量Sham和模型的坐骨神經(jīng)節(jié)段的PLA2活性;其余30只大鼠按分組分別對(duì)模型坐骨神經(jīng)周圍灌注膠原酶溶液100U/0.2ml,地塞米松(0.1mg/0.2ml)或生理鹽水0.2ml。第14天對(duì)所有30只大鼠行雙側(cè)后肢機(jī)械刺激回縮閾值測(cè)量后處死,測(cè)量Sham和模型的坐骨神經(jīng)節(jié)段的PLA2活性。四、機(jī)械刺激行為檢測(cè)行為學(xué)測(cè)量者對(duì)分組及處理方法采用盲法。步態(tài)和后肢姿勢(shì)異常需比較非結(jié)扎側(cè)和結(jié)扎神經(jīng)側(cè),并比較靜止和自主活動(dòng)時(shí)的異常。后肢機(jī)械刺激回縮閾值用標(biāo)刻度的vonFrey纖維確定,彎曲這些尼龍絲,按級(jí)別需用5.88-2940mN的力。動(dòng)物放置在倒置的透明玻璃盒子中,底板用塑料網(wǎng)格。動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)10min后,尼龍絲尖部刺激大鼠后足跖面中心,逐漸增大尼龍絲直徑(刺激力量逐漸加大)直至后足回縮或者達(dá)2940mN的強(qiáng)制停止刺激量。每側(cè)后肢機(jī)械刺激閾值為導(dǎo)致后肢回縮的最小刺激量。強(qiáng)制切斷刺激量2940mN記錄為無(wú)回縮反應(yīng)。五、活性檢測(cè)—PLA2活性測(cè)定大鼠以苯巴比妥鈉(45mg/kg)行腹腔麻醉后切取坐骨神經(jīng)三根分叉部近端長(zhǎng)約1.5cm長(zhǎng)的坐骨神經(jīng),分別置入單獨(dú)的容器,置于-70℃下保存,麻醉動(dòng)物經(jīng)心內(nèi)注射苯巴比妥鈉(100mg/kg)處死。按sPLA2活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書測(cè)定各標(biāo)本sPLA2活性(sPLA2活性=△A414/min/10.66mM-1×0.225ml/0.01ml×樣本稀釋度)。按BCA法蛋白定量試劑盒操作說(shuō)明書測(cè)定各標(biāo)本中蛋白濃度。計(jì)算各標(biāo)本的sPLA2活性。六、機(jī)械刺激回縮閾值spla2數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析:所有動(dòng)物第0、7、14天的sPLA2活性以表示,組間差異用t檢驗(yàn);機(jī)械刺激回縮閾值結(jié)果以表示,按刺激強(qiáng)度不同統(tǒng)計(jì)例數(shù),組間差異用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。結(jié)果一、機(jī)械刺激痛覺(jué)性狀術(shù)后術(shù)前行為學(xué)觀察測(cè)量顯示左右側(cè)無(wú)明顯差異(包括步態(tài)和姿勢(shì)、機(jī)械刺激回縮閾值)。所有行坐骨神經(jīng)結(jié)扎的動(dòng)物均出現(xiàn)遲發(fā)的單根神經(jīng)病的明顯癥狀,一般在術(shù)后24~72h出現(xiàn)癥狀,特征性癥狀為坐骨神經(jīng)結(jié)扎側(cè)出現(xiàn)強(qiáng)直性跖曲、外翻姿勢(shì),足趾緊緊內(nèi)收。無(wú)論休息還是行走時(shí),動(dòng)物不愿意用患側(cè)后肢負(fù)重,常長(zhǎng)時(shí)間處于抬高姿勢(shì)。這些變化導(dǎo)致步態(tài)的明顯異常,使結(jié)扎側(cè)后肢站立期明顯縮短。保護(hù)性行為如避免接觸也同時(shí)出現(xiàn)。這種改變?cè)谛g(shù)后第7天達(dá)到高峰并持續(xù)至術(shù)后第14天處死。對(duì)側(cè)(Sham側(cè))術(shù)后無(wú)行為學(xué)改變。機(jī)械刺激痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。機(jī)械刺激回縮閾值在術(shù)前左右側(cè)后肢均無(wú)明顯差異。第7天(治療前),所有結(jié)扎坐骨神經(jīng)的動(dòng)物均出現(xiàn)結(jié)扎側(cè)嚴(yán)重的機(jī)械刺激痛覺(jué)過(guò)敏(P<0.01,結(jié)扎側(cè)vs.未結(jié)扎側(cè)),各組之間疼痛過(guò)敏程度無(wú)顯著性差異。未結(jié)扎側(cè)回縮閾值與第0天時(shí)比無(wú)明顯變化。給予藥物治療7天后(第14天),機(jī)械刺激痛覺(jué)過(guò)敏在所有結(jié)扎坐骨神經(jīng)的后肢持續(xù)存在,但地塞米松和膠原酶治療組的機(jī)械刺激痛覺(jué)過(guò)敏的程度明顯比鹽水對(duì)照組低(P<0.01);地塞米松組與膠原酶組無(wú)顯著性差異(P>0.05);非結(jié)扎側(cè)后肢機(jī)械刺激回縮閾值同術(shù)前基線水平。二、神經(jīng)節(jié)段sspla2活性的變化各組sPLA2活性變化(圖2)。第7天,結(jié)扎的坐骨神經(jīng)sPLA2活性明顯上升(P<0.01,vs基線);未結(jié)扎的坐骨神經(jīng)節(jié)段sPLA2活性也增加,但和基線比無(wú)顯著性差異(P>0.05);結(jié)扎側(cè)坐骨神經(jīng)節(jié)段的sPLA2活性明顯比未結(jié)扎側(cè)高(P<0.01)。第14天,各組結(jié)扎坐骨神經(jīng)節(jié)段的sPLA2活性都下降,盡管仍比未結(jié)扎側(cè)高(P<0.01),但地塞米松和膠原酶組的sPLA2活性明顯比鹽水對(duì)照組低(P<0.01);地塞米松組和膠原酶組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。盤外給藥效果盡管膠原酶治療椎間盤突出癥的臨床經(jīng)驗(yàn)很多,但其在體內(nèi)的確切作用機(jī)制仍不明確。膠原酶作為蛋白裂解酶降解椎間盤中膠原底物,使椎間盤總體積減少,椎間盤內(nèi)壓力和椎間隙高度降低。一般認(rèn)為椎間盤組織降解及繼發(fā)的再塑型對(duì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)“內(nèi)減壓”,使坐骨神經(jīng)痛癥狀減退。但影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在化學(xué)髓核溶解術(shù)后短期內(nèi)突出椎間盤組織的大小和形態(tài)并沒(méi)有發(fā)生劇烈變化,而有些患者在注射膠原酶后癥狀立刻緩解。說(shuō)明椎間盤的溶解和吸收是相對(duì)遲發(fā)的現(xiàn)象,與臨床癥狀緩解的程度或速度不相對(duì)稱。研究發(fā)現(xiàn)膨出型椎間盤盤內(nèi)注射膠原酶后療效差于突出型。對(duì)突出型椎間盤行椎間盤造影發(fā)現(xiàn)大部分突出椎間盤內(nèi)造影劑沿髓核突出通道外溢至硬膜外間隙。王義清等利用椎間盤造影結(jié)果選擇介入治療方法,發(fā)現(xiàn)對(duì)椎間盤造影顯示造影劑外漏超過(guò)椎間盤后緣的患者行椎間盤內(nèi)注射膠原酶效果好,提示椎間盤內(nèi)注射膠原酶后,膠原酶沿髓核突出方向的裂隙漏出到硬膜外腔可能有助于坐骨神經(jīng)痛的緩解。國(guó)內(nèi)應(yīng)用膠原酶硬膜外腔注射治療腰椎間盤突出癥已相當(dāng)普及。從理論來(lái)說(shuō),盤外給藥的療效應(yīng)該不理想,但臨床實(shí)踐表明確實(shí)是一種有效的給藥方式[18~22],盤外給藥除了通過(guò)控制患者體位,使膠原酶溶液能夠充分被引流到椎間盤突出部分而發(fā)揮作用外,可能有其他因素參與其療效。膠原酶行化學(xué)髓核溶解術(shù)后臨床癥狀改善的時(shí)間曲線與硬膜外注射類固醇激素相似,本研究也發(fā)現(xiàn)膠原酶和地塞米松在抑制PLA2活性及改善病態(tài)行為學(xué)方面作用相似,后者只作用于椎間盤源性坐骨神經(jīng)痛的炎癥反應(yīng)部分;兩種治療均可產(chǎn)生術(shù)后即刻和持續(xù)緩解臨床癥狀的效果,盡管椎間盤突出和神經(jīng)壓迫持續(xù)存在;兩種治療緩解下肢癥狀優(yōu)于腰部癥狀,提示早期治療作用部位在神經(jīng)根而不是椎間盤。最終,如果化學(xué)髓核溶解術(shù)后不能獲得滿意的椎間盤溶解和神經(jīng)減壓,則早期膠原酶的抗炎癥反應(yīng)的療效不能保持。這與臨床上部分患者化學(xué)髓核溶解術(shù)后早期癥狀改善后復(fù)發(fā)相吻合。說(shuō)明膠原酶可能具有激素樣抗炎癥反應(yīng)作用,對(duì)其化學(xué)髓核溶解術(shù)的治療理論基礎(chǔ)有重要意義。Saal等推測(cè)化學(xué)髓核溶解術(shù)可能降解蛋白多糖或膠原的同時(shí)降解髓核基質(zhì)中PLA2,但未能提供這些理論的實(shí)驗(yàn)室及臨床證據(jù)。張紅梅等最初認(rèn)為注射用膠原酶可能水解PLA2,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,劑量從0.6U/ml到2000U/ml的范圍內(nèi),均未發(fā)現(xiàn)注射用膠原酶對(duì)PLA2具有水解作用。進(jìn)一步研究表明,注射用膠原酶在體外對(duì)PLA2的活性具有抑制作用,抑制程度隨膠原酶劑量的增加而增強(qiáng),且表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。這從一個(gè)側(cè)面解釋為什么盤外給藥,在突出物尚未有明顯改善的情況下,也能表現(xiàn)出較好療效的原因。本研究運(yùn)用改良的Bennett-Xie模型,誘導(dǎo)炎癥性神經(jīng)病,相應(yīng)的PLA2活性明顯升高。PLA2活性隨時(shí)間的變化與急性坐骨神經(jīng)痛相關(guān)的行為學(xué)改變相符合進(jìn)一步證實(shí)了PLA2活性是體內(nèi)炎癥反應(yīng)活性的有效標(biāo)志物。本研究中運(yùn)用v