單基因遺傳病致病基因鑒定克隆的歷史與發(fā)展

單基因遺傳病致病基因鑒定克隆的歷史與發(fā)展一、背景致病基因（PathogenicGenes）：如基因因其突變直接導(dǎo)致了某遺傳病的發(fā)生，則該基因?yàn)槟尺z傳病的致病基因，該基因突變則稱為致病突變致病基因突變導(dǎo)致的單基因遺傳病，亦稱為孟德?tīng)栠z傳?。∕endelianHeritableDiseases）一、背景單基因遺傳病包括：常染色體顯性遺傳病（autosomaldominant,AD），如亨廷頓?。℉D）常染色體隱性遺傳?。╝utosomalrecessive,AR），

如Wilson?。╓D）X染色體顯性遺傳?。╔-linkeddominant,XD），

如腓骨肌萎縮癥（CMT）X染色體隱性遺傳?。╔-linkedrecessive,XR），

如假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）Y染色體遺傳?。╕-linked），如外耳道多毛癥線粒體遺傳?。╩itochondrial,mt），

如線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和腦卒中樣發(fā)作（MELAS）一、背景單基因遺傳病少見(jiàn)或罕見(jiàn)，但由于其表型重、治療效果差、致殘致死率高，仍然給家庭、社會(huì)、國(guó)家?guī)?lái)沉重的負(fù)擔(dān)，人們需要了解單基因疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，開(kāi)發(fā)新的診療技術(shù)、治療方法和干預(yù)策略另外一方面，單基因遺傳病也提供了一個(gè)極好的研究疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程的模式，如能促進(jìn)對(duì)復(fù)雜性、常見(jiàn)疾病的發(fā)病機(jī)制研究一、背景單基因遺傳病致病基因鑒定克隆有非常重要的意義，但是從2萬(wàn)5千多個(gè)人類基因中尋找致病基因顯然并非易事，被形象的稱為“干草堆內(nèi)尋針”致病基因的鑒定克隆主要圍繞著三個(gè)方面開(kāi)展位于基因組的位置編碼蛋白的功能與疾病表型關(guān)系

在對(duì)致病基因進(jìn)行鑒定克隆的過(guò)程中，三個(gè)方面的信息是互

相補(bǔ)充、支持一、背景一、背景截止至2014年4月18日，OMIM網(wǎng)站共收錄總條目近22,309條(收錄表型條目7758條)：致病基因3,195個(gè)已明確致病基因的疾病表型條目5,202個(gè)OMIM收錄的基因數(shù)Chr11,456Chr9562Chr17848Chr2928Chr10546Chr18215Chr3793Chr11895Chr19917Chr4567Chr12778Chr20376Chr5663Chr13274Chr21155Chr6874Chr14483Chr22356Chr7697Chr15439X809Chr8523Chr16597Y53二、致病基因的鑒定克隆功能克?。╢unctionalcloning）

基于疾病已知的生化基礎(chǔ)尋找致病基因采用技術(shù)：蛋白質(zhì)測(cè)序、寡核苷酸探針或特異性抗體分離cDNA等

成功案例：苯丙酮尿癥、鐮刀紅細(xì)胞貧血病等

缺點(diǎn)：需要預(yù)先了解疾病相關(guān)蛋白的功能，大部分研

究中的遺傳病不具有這樣的先期條件二、致病基因的鑒定克隆苯丙酮尿癥是小兒神經(jīng)科常見(jiàn)的氨基酸代謝性疾病，因編碼苯丙氨酸羥化酶的PAH基因突變導(dǎo)致其活性降低或喪失，促使過(guò)量苯丙氨酸和旁路代謝產(chǎn)物的堆積，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，造成患兒嚴(yán)重的智能障礙等

1953年，早在PAH基因被鑒定克隆30多年之前，就已經(jīng)明確苯丙酮尿癥是由苯丙氨酸羥化酶的功能異常所造成1982年，Robson等利用特異性抗體通過(guò)免疫共沉淀分離了小鼠肝臟組織中的PAH基因的mRNA病克隆了小鼠的cDNA1985年，Ledley等利用Robson克隆的小鼠PAH基因的cDNA作為探針，從人肝組織cDNA文庫(kù)中成功分離了人PAH基因的cDNA并完成克隆1984年，Lidsky等利用Robson克隆的小鼠PAH基因的cDNA作為探針，運(yùn)用人-鼠細(xì)胞雜交法將人PAH定位在12號(hào)染色體StanleyFetal.ProcNatlAcadSciUSA.1985Sep;82(18):6221-5.LedleyFDFetal.Science.1985Apr5;228(4695):77-9.二、致病基因的鑒定克隆定位克?。╬ositionalcloning）

僅根據(jù)致病基因在染色體的大體位置，鑒定克隆疾病的致病基因采用技術(shù)：連鎖分析、體細(xì)胞雜交、染色體原位雜交等

成功案例：亨廷頓病、假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良等

缺點(diǎn)：需要大的家系作為基礎(chǔ)，且人力物力耗費(fèi)巨大二、致病基因的鑒定克隆亨廷頓病是人類歷史上利用遺傳多態(tài)標(biāo)記定位遺傳病的典型案例1983年， Gusells等通過(guò)艱辛的家系走訪及分子生物實(shí)驗(yàn)，確定了亨廷頓病致病基因與D4S10連鎖；值得一提的是，研究中的一個(gè)委內(nèi)瑞拉家系很可能是至今為止科學(xué)研究中的最大家系，達(dá)3000多人此后，國(guó)際亨廷頓病協(xié)作組通過(guò)不懈的努力，逐漸將定位區(qū)間由最初的大于10cM遺傳距離縮短到2.2cM遺傳距離左右1993年，通過(guò)對(duì)該區(qū)間內(nèi)基因的逐個(gè)鑒定測(cè)序，最終鑒定克隆亨廷頓病的致病基因—IT15（HTT），這已在定位亨廷頓病致病基因整整十年后TheHuntington'sDiseaseCollaborativeResearchGroup..Cell.1993Mar26;72(6):971-83.二、致病基因的鑒定克隆候選克?。╟andidatecloning）

根據(jù)已知基因的相關(guān)信息，直接尋找可能與疾病生理

特征相關(guān)的基因采用技術(shù)：信息分析、體細(xì)胞雜交、寡核苷酸探針cDNA分離等

成功案例：神經(jīng)性耳聾、發(fā)作性過(guò)度運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)

障礙等

缺點(diǎn)：需要其他研究作為前期基礎(chǔ)，具有相當(dāng)大

的不確定性二、致病基因的鑒定克隆神經(jīng)性耳聾的致病基因GJB3就是通過(guò)典型的候選克隆所鑒定在GJB3基因鑒定克隆之前，人們已確定GJB2的是某些常染色體隱性/顯性遺傳性耳聾的致病基因，其編碼的蛋白屬于connexin蛋白家族connexin蛋白在細(xì)胞粘附連接中起到重要作用，connexin蛋白家族有多少成員？其新的成員是否也會(huì)導(dǎo)致遺傳性耳聾？1998年，夏家輝團(tuán)隊(duì)利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，成功發(fā)現(xiàn)了connexin蛋白家族中的第31個(gè)蛋白，其編碼基因是GJB3；并在兩個(gè)神經(jīng)性耳聾家系中發(fā)現(xiàn)了GJB3基因的致病突變，從而鑒定GJB3是神經(jīng)性耳聾的致病基因XiaJHetal.NatGenet.1998Dec;20(4):370-3.二、致病基因的鑒定克隆定位候選克?。╬ositionalcandidatecloning）

是上述克隆策略的結(jié)合采用技術(shù)：連鎖定位、Sanger測(cè)序、RT-PCR等

成功案例：CMT2L、遺傳性帕金森病等

缺點(diǎn)：基于大的家系，在定位區(qū)間內(nèi)尋找致病基

因的工作量仍然相當(dāng)大二、致病基因的鑒定克隆定位候選克隆結(jié)合了定位克隆的優(yōu)點(diǎn)，以家系為基礎(chǔ)，定位致病基因在基因組的位置，從而消除了候選克隆的的不確定性定位候選克隆也吸收了候選克隆的優(yōu)點(diǎn)，從定位區(qū)間一系列基因中通過(guò)生物信息分析篩選候選基因，逐一進(jìn)行致病基因的鑒定二、致病基因的鑒定克隆CMT2L型的致病基因HSPB8就是通過(guò)典型的定位候選克隆所鑒定2004年，我們團(tuán)隊(duì)成功的將一個(gè)CMT2家系的致病基因定位于12q24一個(gè)長(zhǎng)6.8cM的區(qū)域，并命名該型CMT為CMT2L2005年，我們團(tuán)隊(duì)在定位的基礎(chǔ)上，將該定位區(qū)域內(nèi)26個(gè)候選基因逐一進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)HSPB8基因c.423G>T突變?cè)谠摷蚁祪?nèi)共分離且正常人群中未發(fā)現(xiàn)，從而確定HSPB8是CMT2L的致病基因TangBSetal.HumGenet.2004May;114(6):527-33.TangBSetal.HumGenet.2005Feb;116(3):222-4.二、致病基因的鑒定克隆家族性PD致病基因SNCA的克隆是通過(guò)定位候選克隆策略完成1990年，Golbe等在意大利發(fā)現(xiàn)一個(gè)呈常顯遺傳的PD大家系

（4代60多例患者）1995年，Polymeropoulos等運(yùn)用連鎖定位技術(shù)，將致病基因定

位于4q21-q23長(zhǎng)6.04cM區(qū)間其區(qū)間內(nèi)SNCA基因編碼的a-synuclein蛋白已有初步研究結(jié)果，

認(rèn)為與阿爾茨海默病的淀粉樣沉積有關(guān)基于連鎖定位和已知的功能研究，Polymeropoulos認(rèn)定SNCA

是最有可能的候選基因，遂在1997對(duì)前述意大利帕金森病

家系及三個(gè)希臘帕金森病家系進(jìn)行了Sanger測(cè)序分析并家系

共分離，從而證實(shí)SNCA是該家族性帕金森病的致病基因Golbeetal.Annalsofneurology,1990,27(3):276-82.Polymeropoulosetal.Science,1996,274(5290):1197-9.Polymeropoulosetal.Science,1997,276(5321):2045-7.二、致病基因的鑒定克隆新一代測(cè)序克?。╪extgenerationsequencingcloning）

利用高通量測(cè)序鑒定克隆，結(jié)合或獨(dú)立于以往的克隆策略采用技術(shù)：全基因外顯子組測(cè)序、全基因組測(cè)序等

成功案例：SCA35、PKD等

缺點(diǎn)：?jiǎn)蝹€(gè)樣本價(jià)格昂貴、可能存在假陰性或假

陽(yáng)性、對(duì)多種形式的突變無(wú)法檢測(cè)二、致病基因的鑒定克隆新一代測(cè)序技術(shù)克隆是指利用全基因外顯子組測(cè)序、全基因組測(cè)序、目標(biāo)區(qū)域捕獲等高通量測(cè)序技術(shù)，以家系或者同表型疾病群體為研究對(duì)象，尋找遺傳病致病基因的策略新一代測(cè)序技術(shù)克隆可獨(dú)立與以往的鑒定克隆策略，在家系中尋找共有突變（sharedmutation）或是在同表型疾病群體中尋找共有突變基因（sharedmutatedgene），直接得到候選基因也可以與以往的鑒定克隆策略相結(jié)合，利用連鎖分析、生物信息分析等，進(jìn)一步縮小候選基因范圍，進(jìn)一步確認(rèn)致病基因二、致病基因的鑒定克隆SCA35的致病基因TGM6的克隆是通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)鑒定克隆我們團(tuán)隊(duì)，利用連鎖分析，將一個(gè)呈常染色體顯性遺傳的SCA家系的致病基因定位在20p13-12.2長(zhǎng)約18.45cM的區(qū)域通過(guò)對(duì)該家系中的四個(gè)患者進(jìn)行全基因外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在定位區(qū)間內(nèi)只有一個(gè)位于TGM6雜合突變c.1550T>G在四個(gè)患者中共有，經(jīng)Sanger測(cè)序分析證明該突變?cè)诩蚁祪?nèi)共分離在另外一個(gè)呈常染色體顯性遺傳的SCA家系也發(fā)現(xiàn)了TGM6突變，進(jìn)一步從遺傳學(xué)上證明TGM6是SCA35致病基因WangJLetal.Brain.2010Dec;133(Pt12):3510-8.二、致病基因的鑒定克隆我們團(tuán)隊(duì)在一個(gè)呈常染色體隱性遺傳的SCA家系中發(fā)現(xiàn)其致病基

因CHIP，也運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)策略利用連鎖分析，將該家系致病基因定位在16p13.3長(zhǎng)約8.55cM的

區(qū)域通過(guò)對(duì)家系中兩名患者進(jìn)行全基因外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩者在此

區(qū)域共有的純合突變僅有位于CHIP基因的c.493C>T突變并在家系

內(nèi)共分離在兩個(gè)SCA家系中也發(fā)現(xiàn)了CHIP的突變且共分離，從而進(jìn)一步證明了CHIP是常染色體隱性遺傳的SCA的致病基因ShiYetal.PLoSOne.2013Dec2;8(12):e81884.二、致病基因的鑒定克隆2011年，Najmabadi等對(duì)136個(gè)近親結(jié)婚成隱性遺傳的智力障礙伊朗家系中的患者進(jìn)行全基因外顯子組測(cè)序并利用數(shù)據(jù)進(jìn)行純合子定位，發(fā)現(xiàn)了23個(gè)已知致病基因和50個(gè)新的待驗(yàn)證的智力障礙致病基因Najmabadietal.Nature.2011Sep21;478(7367):57-63.二、致病基因的鑒定克隆我們團(tuán)隊(duì)利用新一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行堿基變異分析，同時(shí)開(kāi)展純合子定位我們將該近親結(jié)婚呈隱性遺傳的進(jìn)行性肌陣攣癲癇（PME）家系中兩位患者進(jìn)行全基因外顯子組測(cè)序，并利用測(cè)序數(shù)據(jù)中的變異檢測(cè)得到的SNP點(diǎn)的基因型完成純合子定位，最終發(fā)現(xiàn)兩患者共有且位于純合子定位區(qū)域的突變僅有位于SCARB2的c.1286G>A突變，證實(shí)該家系為極罕見(jiàn)的一種PME亞型HeMetal.ClinGenet.2014Mar13.doi:10.1111/cge.12338..二、致病基因的鑒定克隆一些發(fā)病年齡早、表型重的疾病，很難形成家系，如孤獨(dú)癥等，目前采用對(duì)正常父母+患病兒童高通量測(cè)序?qū)ふ倚掳l(fā)突變的策略，已取得相當(dāng)大成果O'RoakBJetal.NatGenet.2011Jun;43(6):585-9.二、致病基因的鑒定克隆另外,現(xiàn)代社會(huì)大家系越來(lái)越少，采用累積同表型小家系（2~3名患者）并對(duì)患者進(jìn)行高通量測(cè)序后尋找共有基因的策略，也有一些研究團(tuán)隊(duì)特別是協(xié)作組開(kāi)始采用，如癲癇Epi4K協(xié)作組就已采用累積癲癇小家系的策略尋找癲癇致病基因，擬于2015~2016年公布結(jié)果Epi4KConsortium.Epilepsia.2012Aug;53(8):1457-67.泛素及類泛素系統(tǒng)基因突變導(dǎo)致多種神經(jīng)變性疾病PeptidesKawaguchietal.,1994;Kitadaetal.,1998;Leroyetal.,1998;Dingetal.,2006;Raoetal.,2010;Zhaoetal.,2011;Dengetal.2012;Margolinetal.,2013;Shietal.,2013.泛素活化酶(E1)泛素連接酶(E3)26SProteasome靶蛋白UbUbUbUb泛素/類泛素分子泛素結(jié)合酶(E2)靶蛋白靶蛋白類泛素分子細(xì)胞生理過(guò)程UbUb