蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)課件

蘆丁的鑒別及含量測定小組成員：陳麗、陳惠渝、黃雄、李鈺川蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗?zāi)康氖煜S酮類化合物的化學(xué)檢識的常用方法掌握蘆丁紫外吸收光譜測定的方法與原理學(xué)習(xí)用紫外分光光度法測定蘆丁提取物的含量蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理

蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識1.對不同強度堿液的溶解度試驗2.濃硫酸和濃鹽酸反應(yīng)3.Molish反應(yīng)4.鹽酸-鎂粉試驗5.FeCl3反應(yīng)6.AlCl3反應(yīng)蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理對不同強度堿液的溶解度試驗：黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基，故顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。由于酚羥基的數(shù)目及位置不同，酸性強弱也不同。以黃酮為例，其酚羥基酸性強弱順序依次為：7,4‘-二OH>7-或4’-OH>一般酚OH>5-OH>3-OH因此，酚羥基的數(shù)目及位置不同的黃酮類化合物酸性不同，在不同強度堿液中的溶解度也不同。蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理濃硫酸和濃鹽酸反應(yīng)：

γ-吡喃環(huán)上的1-氧原子，因有未共用的電子對，故表現(xiàn)微弱的堿性，可與強無機酸，如濃硫酸、鹽酸等生成鹽，但生成的鹽極不穩(wěn)定，加水后即可分解。另外，黃酮類化合物溶于濃硫酸中常常表現(xiàn)出特殊的顏色，可用于鑒別。蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理Molish反應(yīng)：糖在濃硫酸或濃鹽酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與α-萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物，在糖液和濃硫酸的液面間形成紫環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。Molish反應(yīng)可以鑒定單糖的存在。蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理鹽酸-鎂粉試驗：鹽酸-鎂粉反應(yīng)的機制過去解釋為由于生成了花色苷元所致，現(xiàn)在認(rèn)為是因為生成了陽碳離子的緣故。FeCl3及AlCl3反應(yīng)：黃酮類化合物分子中常含有下列結(jié)構(gòu)單元，故?？膳c鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽等試劑反應(yīng)，生成有色絡(luò)合物。

蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理

苯甲?；鹌；S酮類化合物結(jié)構(gòu)中的交叉共軛蘆丁的紫外吸收光譜的測定：蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理

蘆丁的紫外吸收光譜的測定多數(shù)黃酮類化合物由兩個主要吸收帶組成：

帶I在300-400nm區(qū)間，由B環(huán)桂皮酰系統(tǒng)的電子躍遷引起。BB蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理

帶II在240-285nm區(qū)間，由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)的電子躍遷所引起。AA蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理

苯甲?；鹌；S酮類化合物結(jié)構(gòu)中的交叉共軛蘆丁的紫外吸收光譜的測定：蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)說明：（1）+NaOMe或NaOAc,OH

ONa，變?yōu)殡x子化合物，共軛系統(tǒng)中的電子云密度增加，紅移另有3,4’-OH或3,3’,4’-OH時，在NaOMe作用下易氧化破壞，故峰有衰減。（2）NaOAc為弱堿，僅使酸性較強者，如7,4’-OH解離。實驗原理蘆丁的紫外吸收光譜測定蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)（3）形成絡(luò)合物的能力：黃酮醇3-OH>黃酮5-OH（二氫黃酮5-OH）>鄰二酚羥基>二氫黃酮醇5-OH鄰二酚羥基和二氫黃酮醇5-OH在酸性條件下不與AlCl3絡(luò)合；但不在酸性條件下，五者皆與Al3+絡(luò)合；形成絡(luò)合物越穩(wěn)定，紅移越多。蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)（4）根據(jù)只加AlCl3和加入AlCl3及鹽酸的紫外光譜吸收峰位相減的結(jié)果，可以判斷鄰二酚羥基的取代情況。蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)

帶II(240-285nm)（苯甲酰系統(tǒng)）帶I(300-400nm)桂皮酰系統(tǒng)類型說明

250-285304-350黃酮類

-OH越多，帶I帶II越紅移

B環(huán)3’,4’有-OH基，帶II為雙峰（主峰伴肩峰）328-357黃酮醇類(3-OR)

352-385黃酮醇類(3-OH)

245-270270-295300-400異黃酮類二氫黃酮（醇）B環(huán)上有-OH,OCH3對帶I影響不大

220-270340-390或340-390(Ia)300-320(Ib)查耳酮類查耳酮2’-OH使帶I紅移的影響最大370-430(3-4個小峰)橙酮類

蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)加入試劑帶II帶I說明樣品+甲醇（黃酮類及黃酮醇類）250-285304-385兩峰強度基本相同，具體位置與母核上電負(fù)性取代基(-OH,-OCH3)有關(guān)，-OH,-OCH3越多，越長移

+NaOMeA環(huán)有-OH，紅移小，無意義

40-60nm（

不變或增強）

50-60nm（

下降）有4’-OH，無3-OH

有3-OH，無4’-OH有3,4’-OH或3,3’,4’-OH（衰減更快）

7-OH帶I，II隨加NaOMe時間延長，逐漸衰減

320-330nm有吸收，成苷后消失+NaOAc(未熔融)

5-20在長波一側(cè)有明顯的肩峰7-OH加入診斷試劑后引起的位移及結(jié)構(gòu)測定蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)+NaOAc(熔融)

40~65有4’-OH+NaOAc/H3BO3

5-10

12-30有6,7-OH或7,8-OH(5,6-OH無)B環(huán)有鄰二酚羥基

AlCl3/HCl

60

50-60

35-55

17-20

0有3-OH有3,5-二OH有5-OH，無3-OH有6-OR無3-OH,5-OHAlCl3光譜-AlCl3/HCl光譜

30-4050-650B環(huán)有鄰二酚羥基A,B環(huán)皆有鄰二酚羥基A,B環(huán)皆無鄰二酚羥基蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗原理

蘆丁提取物含量的測定：在黃酮類化合物的紫外光譜圖上主要有兩個吸收帶:環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶1(300)550nm)和環(huán)苯酰系統(tǒng)引起的吸收帶2(240)280nm)。若加入鋁鹽,則鋁離子與黃酮化合物形成穩(wěn)定的配合物,帶2會明顯向長波方向移動(紅移);在NaNO2的強堿性溶液中,其在500nm左右吸光度值最大,從而為分光光度法測定提供了可靠的依據(jù)注意：用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測定總黃酮含量時,必須嚴(yán)格保證稀釋定容用乙醇的濃度、試劑加入時間、顯色時間等測試環(huán)節(jié)前后完全一致,否則會出現(xiàn)很大誤差。蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗試劑及儀器試劑：蘆丁及槲皮素樣品、稀氨水、5%NaHCO3水溶液、5%Na2CO3水溶液、1%NaOH水溶液、濃酸、濃硫酸、乙醇、α-萘酚、鎂粉、1%FeCl3醇溶液、1%AlCl3醇溶液、無水甲醇、甲醇鈉溶液、AlCl3無水甲醇溶液、（1：1）鹽酸、無水醋酸鈉、硼酸、60%乙醇、30%乙醇、亞硝酸鈉溶液（1：20）、硝酸鋁溶液（1：10）、4%NaOH水溶液、蒸餾水等儀器：試管若干支、滴管若干個、移液管若干支（公用）、藥匙、100ml、50ml、10ml容量瓶各一個、紫外分光光度計等蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(1)對不同強度堿液的溶解度試驗：蘆丁槲皮素蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟(2)濃硫酸和濃鹽酸反應(yīng)：(3)Molish反應(yīng)：蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟(4)鹽酸–鎂粉試驗:蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟(5)FeCl3反應(yīng)蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟(6)AlCl3反應(yīng)蘆丁的紫外吸收光譜測定蘆丁提取物含量的測定蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟蘆丁的紫外吸收光譜測定：測定方法：精密稱取蘆丁l0mg于l00mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻。從中吸取5mL于50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；搖勻備用（10μg/mL)A、甲醇光譜：取樣品溶液置石英杯中，200~400nm內(nèi)進行掃描，重復(fù)一次，觀察紫外光譜。

B、甲醇鈉光譜：取樣品液置石英杯中，加入甲醇鈉溶液3滴后，立即測定。放5分鐘后再測一次。

C、AlCl3光譜：在置有樣品液的石英杯中加入AlCl3溶液6滴，停1分鐘后進行測定。然后加入3滴鹽酸(HCl:水=1:1)再進行測定。蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟D、醋酸鈉光譜；取樣品溶液3mL，加入過量的無水醋酸鈉固體，搖勻(杯底剩有少量的醋酸鈉，2分鐘內(nèi)測定，5～10分鐘后再測一次。E、醋酸鈉硼酸光譜：

方法2蘆丁和槲皮素的化學(xué)檢識(2)實驗步驟蘆丁提取物的含量測定：(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：(2)測定：精密稱取精制蘆丁20mg，置l00mL量瓶中，加60％乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取25mL，置50mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得0.1mg/mL的樣品液。精密吸取樣品液3.0mL置10mL量瓶中，加30％乙醇使成5mL。精密加亞硝酸