醫(yī)院培訓(xùn)課件：《CNV-seq簡介及臨床應(yīng)用》

CNV-seq簡介&臨床應(yīng)用

目錄1.CNV-seq簡介及其臨床應(yīng)用2.常用數(shù)據(jù)庫的使用CNV-seq簡介及其臨床應(yīng)用染色體核型分析正常人體細(xì)胞有23對染色體常見染色體異常類型易位倒位缺失重復(fù)常見染色體異常類型染色體異常是導(dǎo)致自然流產(chǎn)、先天畸形、智力障礙、發(fā)育遲緩的重要原因各疾病染色體異常發(fā)生率參考文獻(xiàn)：[1]張建平.流產(chǎn)基礎(chǔ)與臨床.北京.人民衛(wèi)生出版社,2012:189.[2]盧丹，陳欣林.產(chǎn)前胎兒超聲檢查結(jié)果與胎兒染色體檢測結(jié)果的對比分析[A].見中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會：中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第三屆全國婦產(chǎn)及計劃生育超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C]成都：2010.128-131.[3]耿茜,羅福薇,李娟,等.167例胎兒先天畸形與染色體異常的相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2011(5):589-590.[4]ReddyUM,PageGP,SaadeGR,etal.KaryotypeversusMicroarrayTestingforGeneticAbnormalitiesafterStillbirth[J].NewEnglandJournalofMedicine,2012,367(23):2185-93.[5]鄔玲仟,張學(xué).醫(yī)學(xué)遺傳學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,2016:97.[6]VissersLEetal.Geneticstudiesinintellectualdisabilityandrelateddisorders.[J]NatRevGenet.2016Jan;17(1):9-18.50-60%[1]自然流產(chǎn)40-50%[2-3]胎兒多發(fā)畸形6-13%[4]死胎10%[5]新生兒死亡55-70%[6]中至重度智力障礙染色體異常發(fā)生率疾病類型8康孕?-染色體檢測系列簡介通過對受檢樣本提取DNA，如胚胎絨毛組織、胎兒組織、羊水、臍帶血、外周血等，采用高通量測序技術(shù)，結(jié)合短串聯(lián)重復(fù)序列分析（shorttandemrepeat,STR），全面檢測23對染色體非整倍體變異，三倍體變異，100Kb以上的缺失、重復(fù)。排查自然流產(chǎn)、先天畸形、智力障礙、發(fā)育遲緩等疾病的遺傳病因?？翟?-染色體檢測項目列表產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱檢測范圍檢測周期SD0060康孕?-染色體檢測-三倍體三倍體7個工作日DX0006康孕?-染色體檢測-1M23對染色體非整倍體；三倍體；1Mb以上的缺失、重復(fù)。7個工作日DX0007康孕?-染色體檢測-100K23對染色體非整倍體異常；100Kb以上的缺失、重復(fù)。12個工作日康孕?-染色體檢測項目列表臨床應(yīng)用場景(1)流產(chǎn)查因遺傳因素子宮因素子宮形態(tài)異常、宮頸機(jī)能不全等外界因素免疫因素母-胎免疫應(yīng)答低下或自身免疫損傷內(nèi)分泌功能異常黃體功能不全、甲狀腺功能異常等胚胎因素遺傳外界子宮免疫內(nèi)分泌母體因素染色體或基因的異常，遺傳病，配子/合子在發(fā)育過程中發(fā)生變異；物理、化學(xué)因素（放射線、重金屬、有機(jī)溶劑、藥物等）、感染（病毒、弓形蟲等）自然流產(chǎn)的原因染色體異常對自然流產(chǎn)的影響31%胚胎著床后自然流產(chǎn)[1]臨床上可統(tǒng)計到的自然流產(chǎn)發(fā)生率15%-25%[1]80%以上自然流產(chǎn)發(fā)生在孕早期[2]50~60%孕早期自然流產(chǎn)由染色體異常造成[2][1]AmericanSocietyforReproductiveMedicine,Birmingham,Alabama.Evaluationandtreatmentofrecurrentpregnancyloss:acommitteeopinion[J].FertilityandSterility,2012,98(5):1103-1111.[2]謝杏,茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)(第8版).北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:47.國外行業(yè)指南—對流產(chǎn)物應(yīng)進(jìn)行染色體檢測美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會（ASRM）、英國皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會（RCOG）、歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會（ESHRE）均認(rèn)為，對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦，應(yīng)進(jìn)行流產(chǎn)物的染色體檢測。①流產(chǎn)最常見的原因？約60%由胚胎染色體數(shù)目異常導(dǎo)致，隨機(jī)發(fā)生。②其他導(dǎo)致流產(chǎn)的遺傳因素？夫婦一方染色體存在易位，會存在產(chǎn)生異常配子可能，形成染色體異常胚胎，導(dǎo)致自然流產(chǎn)。專家共識：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)應(yīng)進(jìn)行染色體檢測綜述：早期自然流產(chǎn)樣本染色體核型分析結(jié)果MmVDB,vanMaarleMC,VanWM,etal.Geneticsofearlymiscarriage.[J].BiochimicaEtBiophysica

Acta,2012,1822(12):1951-1959.該綜述分析13項研究，7012個樣品的染色體核型分析結(jié)果，核型分析檢測成功率79%染色體異常陽性率約45%，其中三體63%，多倍體17%，X單體11%，結(jié)構(gòu)異常6%流產(chǎn)組織染色體陽性檢測結(jié)果分布華大2017.09-2019.05數(shù)據(jù)流產(chǎn)組織中染色體異常比例56.4%三倍體占其中11.5%三倍體，不可忽視的自然流產(chǎn)遺傳病因！加量不加價康孕?-染色體檢測-5M1MNGS+短串聯(lián)重復(fù)序列分析（shorttandemrepeat,STR），全面檢測23對染色體非整倍體變異，三倍體變異，1Mb缺失、重復(fù)，可將流產(chǎn)組織檢出率大幅提高。[1]AmericanSocietyforReproductiveMedicine,Birmingham,Alabama.Evaluationandtreatmentofrecurrentpregnancyloss:acommitteeopinion[J].FertilityandSterility,2012,98(5):1103-1111.[2]謝杏,茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)(第8版).北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:47.[3]

張建平.流產(chǎn)基礎(chǔ)與臨床.北京.人民衛(wèi)生出版社,2012:189.康孕?-染色體檢測-1M全新推出檢測精度提升檢測精度由5Mb提升到1Mb。檢出率提升對于流產(chǎn)組織染色體缺失/重復(fù)（CNV）的檢出率提升約30%[1]。加量不加價常規(guī)檢測三倍體、23對染色體非整倍體及5Mb以上的缺失/重復(fù)；額外檢測1-5Mb的染色體缺失/重復(fù)。交付周期更短收到合格樣本之日起7個工作日出具報告。

升級前升級后產(chǎn)品名稱康孕?-染色體檢測-5M康孕?-染色體檢測-1M檢測范圍三倍體；23對染色體非整倍體；5Mb以上缺失/重復(fù)三倍體；23對染色體非整倍體；1Mb以上缺失/重復(fù)適用人群≤12周自然流產(chǎn)樣本類型胚胎絨毛組織或DNA檢測周期10個工作日7個工作日檢測價格相同[1]華大內(nèi)部數(shù)據(jù)案例分析陳某，女，23歲，G3P0，“稽留流產(chǎn)”終止妊娠后取絨毛組織送檢康孕?-染色體檢測。檢測結(jié)果：46,XN,del（10）（q24.1q26.3）,dup（1）(q42.2q44)結(jié)果解讀：受檢樣本第10號染色體長臂部分存在片段丟失，長約37.96Mb；第1號染色體長臂部分存在片段重復(fù)，長約17.64Mb。檢測結(jié)果：男方染色體無異常；女方46,XX,t(1;10)(q25;q11)，即存在平衡易位。診療建議：平衡易位攜帶者雖無異常臨床表型，也有生育能力，但因產(chǎn)生異常配子的可能性大，因此反復(fù)發(fā)生流產(chǎn)、生育染色體異?；純旱娘L(fēng)險也隨之升高。建議患者根據(jù)實際情況選擇合適的生育方案：①自然妊娠，孕期行產(chǎn)前診斷；②利用胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）技術(shù)選擇診斷正常胚胎移植?？紤]到該患者反復(fù)自然流產(chǎn)史，為判斷變異來源，夫妻均行染色體核型分析。受檢樣本第10號染色體長臂部分（97,413,009-135,524,695）位置附近存在片段丟失，長約37.96Mb；第1號染色體長臂部分（231,265,745-248,908,210）位置附近存在片段重復(fù)，長約17.64Mb案例分析劉××，28歲，孕9w發(fā)現(xiàn)胚胎停育染色體異常為偶發(fā)雙親染色體正常流產(chǎn)組織染色體檢測優(yōu)化臨床診療流程①子宮解剖異常（12%-15%）：B超、宮腔鏡、腹腔鏡…②內(nèi)分泌因素（12%-15%）：孕激素測定，甲功…③感染因素：TORCH[注]...④免疫因素（50%-60%）：檢測繁多，主要靠排除法。雙親染色體正常流產(chǎn)組織染色體檢測陰性繼續(xù)尋找其他原因陽性染色體異常為偶發(fā)（即發(fā)現(xiàn)病因）減少不必要的其他原因?qū)ふ译p親至少一方平衡易位自然懷孕+產(chǎn)前診斷輔助生殖+PGD2-5%[2]50-60%[1][1]謝杏,茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)(第8版).北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:47.[2]RoyalCollegeofObstetriciansandGynaecologists.TheInvestigationandTreatmentofCoupleswithRecurrentFirst-trimesterandSecond-trimesterMiscarriage.Green–topGuidelineNo.17.London:RCOG;2011.[注]TORCH指可導(dǎo)致先天性宮內(nèi)感染及圍產(chǎn)期感染而引起圍產(chǎn)兒畸形的病原體，它是一組病原微生物的英文名稱縮寫：T（Toxoplasma)是弓形蟲，R(Rubella.Virus)是風(fēng)疹病毒，C(Cytomegalo.Virus)巨細(xì)胞病毒，H(Herpes.Virus)單純皰疹I(lǐng)/II型。臨床應(yīng)用場景(2)輔助產(chǎn)前診斷輔助排查孕期胎兒超聲異常原因◆適用項目：康孕?-染色體檢測-100K◆送檢樣本：羊水、臍帶血或DNA◆檢測內(nèi)容：23對染色體非整倍體；100Kb以上缺失、重復(fù)◆檢測周期：12個工作日胎兒結(jié)構(gòu)畸形等B超異常胎兒結(jié)構(gòu)畸形等超聲異常與染色體異常密切相關(guān)各種超聲異常表現(xiàn)胎兒的染色體異常陽性率摘自：尹愛華第十屆全國遺傳病診斷與產(chǎn)前診斷學(xué)術(shù)交流會幻燈數(shù)據(jù)CNV-seq提高產(chǎn)前染色體異常的發(fā)現(xiàn)率與核型分析相比，CNV-seq對高風(fēng)險孕婦致病或疑似致病的染色體異常檢出率由1.8%提高至2.8%與CMA相比，能檢測到部分CMA漏檢的致病性CNVsCNV-seq用于產(chǎn)前診斷已形成專家共識“具備條件的產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)可將CNV-seq作為一線產(chǎn)前診斷技術(shù)”CNV-seq的適用范圍對于有介入性產(chǎn)前診斷指征或需求的孕婦，在其充分知情的前提下，可將CNV-seq作為一線的產(chǎn)前診斷方法供其選擇；（高齡、篩查高風(fēng)險、超聲異常等）胎兒核型分析不能確定染色體畸變的來源和構(gòu)成者；胎兒新發(fā)染色體結(jié)構(gòu)重排且無法排除重排過程是否導(dǎo)致染色體微缺失/微重復(fù)者；夫婦為染色體平衡重排攜帶者；需要行產(chǎn)前診斷排除染色體異常，但已無法進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)的中晚期孕婦；流產(chǎn)物、死胎或死產(chǎn)胎兒組織需明確遺傳學(xué)病因者。CNV-seq優(yōu)勢明顯，多種技術(shù)聯(lián)用可檢出最大化CNV-seq優(yōu)勢：檢測范圍廣：覆蓋全部染色體非整倍體、大片段缺失/重復(fù)及全基因組CNVs；高通量：可緩解產(chǎn)前診斷服務(wù)供給嚴(yán)重不足的矛盾；操作簡便：實驗流程簡便，數(shù)據(jù)分析自動化程度高，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)清晰，在節(jié)省人力的同時降低人為誤差風(fēng)險；兼容性好：一臺高通量測序儀可同時進(jìn)行NIPT和CNV-seq檢測，有效節(jié)約實驗室的空間和設(shè)備成本；低比例嵌合檢測效果好：可檢測>10%的低比例嵌合；所需DNA樣本量少：可檢測10-50ng的DNA樣本。CNV-seq局限性：無法發(fā)現(xiàn)三倍體和多倍體無法發(fā)現(xiàn)易位/倒位，也無法區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)型三體和易位型三體；提示性染色體拷貝數(shù)異常，需進(jìn)一步FISH明確嵌合；47，XXX和45，XO等比例嵌合，會判定為無異常；無法對包括單親二倍體（UPD）在內(nèi)的雜合性缺失（LOH）進(jìn)行檢測；高度懷疑者用STR、SNP

array；對高度重復(fù)區(qū)域存在局限性，部分CNV不能被檢出；曾某，女，26歲，孕1產(chǎn)0，末次月經(jīng)2018.11.13，無特殊病史。孕11+周彩超提示NT2.5mm，為正常高值。臨床案例分享3月17日孕17+周行介入性產(chǎn)前診斷，4月3日完善系統(tǒng)彩超。臨床應(yīng)用場景(3)輔助疑似染色體異常患者診斷智力障礙、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形康孕染色體檢測助力疑似患者診斷

1/160的活產(chǎn)嬰兒可檢出染色體異常[1]。這些染色體異常的胎兒雖可活產(chǎn)，但可能有智力障礙、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等表現(xiàn)，且目前無有效的治療手段。唐氏綜合征（21三體）3q重復(fù)綜合征（3q21-qter，重復(fù)）貓叫綜合征（5p-綜合征，缺失）◆適用項目：康孕?-染色體檢測-100K◆送檢樣本：外周血或DNA◆檢測內(nèi)容：23對染色體非整倍體；100Kb以上缺失、重復(fù)◆檢測周期：12個工作日先天畸形、智力障礙、發(fā)育遲緩患者或疑似患者[1]LuthardtFW,KeitgesE.ChromosomalSyndromesandGeneticDisease[M]//eLS.JohnWiley&Sons,Ltd,2001.專家共識：不明原因智力障礙應(yīng)進(jìn)行染色體檢測在我國，智力障礙發(fā)病率為0.43%-0.96%。智力障礙中，遺傳因素占50%；中至重度智力障礙中遺傳因素高達(dá)2/3以上。CMA在智力障礙或全面發(fā)育遲緩患者中診斷率為10%-19%。CMA為排查不明原因智力障礙的一線診斷手段。CNV-seq在疑似染色體病患者群體檢測效力與CMA相當(dāng)62例疑似染色體病患者分別進(jìn)行了SNP-array和CNV-seq，其中致病性的CNVs62個，兩種技術(shù)均檢出。CNV-seq較之SNP-array多檢出5個VOUS。17例疑似染色體病患者樣本，分別進(jìn)行了SNP-array和CNV-seq，兩種技術(shù)均檢出了所有的9個致病性CNVs，NGS較之SNP-array多檢出6個VOUS。疑似染色體異常患者診斷臨床案例分享先證者為6歲女孩，臨床表現(xiàn)為智力低下；斜頸；斷掌；雙腎輕度積水。先證者有一3歲弟弟，臨床表型與先證者相似。兩人父母均無異常臨床表現(xiàn)。先證者行CNV-seq檢測，結(jié)果提示其在9號、10號、12號、22號染色體上均存在大小不同的CNVs。其中22q13區(qū)域6.26M的缺失片段為“22q13deletionsyndrome（Phelan-Mcdermidsyndrome）”相關(guān)區(qū)域Phelan-Mcdermidsyndrome的臨床表現(xiàn)主要包括新生兒肌張力低下、發(fā)育遲緩、嚴(yán)重的語言發(fā)育遲緩及外觀異常等臨床表現(xiàn)。部分患者有斜頸，斜頭畸形，腎積水等表征?？紤]該CNV是導(dǎo)致先證者臨床表現(xiàn)異常的原因先證者查因家系驗證與先證者表型相似的弟弟同樣在22q13.3區(qū)域存在6.26M的缺失片段先證者的父親臨床未見異常表型，CNV-seq結(jié)果為陰性先證者的母親臨床未見異常表型，CNV-seq結(jié)果提示其9q34.3遠(yuǎn)端片段與22q13.31遠(yuǎn)端片段發(fā)生了平衡易位?？紤]先證者及其弟弟染色體CNV片段來源于其攜帶平衡易位的母親。夫妻后續(xù)生育指導(dǎo)由于平衡易位攜帶者生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時有1/18的概率產(chǎn)生正常配子，郴州市第一人民醫(yī)院的臨床醫(yī)生建議該夫婦行PGT輔助生殖并在孕期行必要的產(chǎn)前診斷2019年初，夫婦借助PGT輔助生殖再次懷孕，孕期羊穿樣本CNV-seq結(jié)果為陰性目前該寶寶已出生，身體健康臨床科研成果的產(chǎn)出康孕-染色體產(chǎn)品選擇≤12孕周早期流產(chǎn)1M

+三倍體100K>12孕周晚期流產(chǎn)、死胎、B超異常、多發(fā)畸形出生后智力障礙、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形送檢材料如何使用？適用對象送檢樣本送檢產(chǎn)品自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織、胎兒組織、DNA≤12周自然流產(chǎn)——1M＞12周自然流產(chǎn)——100K出生前婦產(chǎn)科送檢材料如何使用？適用對象送檢樣本送檢產(chǎn)品新生兒、兒童、成年人有智力障礙、多發(fā)畸形、發(fā)育遲緩等表現(xiàn)。外周血、臍帶血、DNA100K；出生后新生兒科、兒科、遺傳科樣本采集規(guī)范樣本類型樣本采集器樣本量注意事項胚胎絨毛組織、胎兒組織60ml痰液杯（華大提供）流產(chǎn)組織盡量保證完整；胎兒組織若體積過大可切取蠶豆大小（>100mg）。生理鹽水或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗樣本至無血色；切勿培養(yǎng)、固定、包埋及福爾馬林處理。胎兒羊水Corning15ml滅菌帶蓋離心管≥10mL。無母體血液污染。臍帶血EDTA抗凝管（塑料材質(zhì)）康孕?-染色體檢測-100K：≥1ml。不可用肝素抗凝采血管取樣。外周血EDTA抗凝管（塑料材質(zhì)）兒童或成年人：≥5mL；新生兒：≥1mL。不可用肝素抗凝采血管取樣。DNA1.5mlEP管濃度：≥30ng/μL；OD260/280：1.8-2.0之間；康孕?-染色體檢測-1M/100K：≥1μg。DNA儲存液不可含十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑。請在文控系統(tǒng)下載查看：[康孕+樣本采集手冊]DOC-CHP-02V1.5康孕?-染色體檢測樣本采集手冊流產(chǎn)組織收樣注意事項流產(chǎn)樣本沖洗干凈取樣送樣容器樣本暫存包裝運輸樣本中心不合格塑料袋生理鹽水或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗樣本至無血色。排除母血污染。早期流產(chǎn)組織：完整的絨毛。60mL痰液杯痰液杯擰緊密封，避免漏液污染。＜8h，≤4℃；8-72h，≤-20℃；＞72h，≤-80℃；胎兒組織：臀部或大腿的肌肉組織，蠶豆大小。不建議用自來水，可能影響實驗結(jié)果。可向物料組申請禁止室溫放置，避免反復(fù)凍融。周圍加足量干冰，過少則樣本腐壞。切勿進(jìn)行培養(yǎng)、固定、包埋及福爾馬林處理。絨毛組織常用數(shù)據(jù)庫的使用數(shù)據(jù)庫-UCSC1.選擇所需的基因組參考序列版本