醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課件：基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法

2023/12/71基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法基本原理抗原（表位）和抗體（高變區(qū)）分子結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型的互補(bǔ)。

Lockandkeymodel2023/12/73氫鍵疏水作用

范德華引力

靜電吸引作用抗原-抗體結(jié)合力特異性

非共價(jià)鍵可逆性

抗原抗體反應(yīng)的基本類型

1.Precipitation---沉淀反應(yīng)2.Agglutination---凝集反應(yīng)3.Radioimmunoassay4.Enzyme-linkedImmunosorbentAssay5.Immunofluorescence6.WesternBlotting7.FlowCytometry8.ImmunoelectronMicroscopy沉淀反應(yīng)（Precipitation）：

可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物。

凝集反應(yīng)（Agglutination）：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物。免疫沉淀反應(yīng)(precipitation)

原理：可溶性抗原+抗體白色沉淀實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：?jiǎn)蜗蚨棵庖唠娪?火箭電泳)瓊脂糖雙向免疫擴(kuò)散

單向定量免疫電泳(火箭電泳)

把抗原放在含有抗體的凝膠內(nèi)電泳，其沉淀弧形似火箭。當(dāng)定量的抗原在含有適量抗體的瓊脂中泳動(dòng)時(shí)，走在前面的抗原遇到瓊脂中的抗體時(shí)，達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)形成大的不溶性復(fù)合物而發(fā)生沉淀，不再移動(dòng)；未與抗體結(jié)合的抗原以及較小的可溶性復(fù)合物可穿過此沉淀繼續(xù)向前遷移，形成新的沉淀，但沉淀帶越來越窄，直至全部抗原與抗體結(jié)合形成火箭峰樣沉淀。抗原含量越高，火箭峰越長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)流程抗體+瓊脂瓊脂板

打孔數(shù)個(gè)(孔與板緣距離1cm)

加入樣品(由低濃度到高濃度)

電泳2023/12/7912345

Add50uldilutionbuffer（稀釋液）toNo.1-5tubesseparatelyAdd50ulstandardsolution（標(biāo)準(zhǔn)品,Ag）toNo.1，上下吹打混勻；Transfer50ulliquidfromNo.1toNo.2tube,sotheconcentrationofsolutioninNo.2ishalfofNo.1(1:4)；Suck50ulliquidfromNo.2andthenpipettetoNo.3tube,sotheconcentrationofNo.3solutionishalfofNO.2(1:8)……No.C1:21:41:81:161:32SerialDilution1.倍比稀釋（SerialDilution）

1:21:41:81:161:3250ul稀釋液50ul血清50ul50ul2.打孔templateagaroseslide將膠版置于模板上，用打孔器在瓊脂板的一端垂直，間隔均勻地打一排小孔，用針頭小心，完整地挑出孔中瓊脂3.加樣每孔小心加入10l

樣品1－5孔加入1:32,1:16,1:8,1:4,1:2的標(biāo)準(zhǔn)品

剩下一孔加入待測(cè)樣品。1:32,1:16,1:8,1:4,1:2,sample4.電泳將瓊脂板放入電泳槽電泳:80v,

2－3h.13+-2023/12/714實(shí)驗(yàn)步驟1.取熔化并冷卻至50°c的1%瓊脂糖凝膠，加入anti-IgG抗體，混勻后澆至玻璃板上；2.凝固后，如下圖打孔；3.第1-5孔加入10

l經(jīng)倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)血清樣品：

1:32，1:16，1:8，1:4，1:2。第6孔加入待測(cè)血清；4.將瓊脂板放入電泳槽，用濾紙與電泳槽搭橋連接，樣品孔一端接負(fù)極。電泳80v，2-3h。（-）（+）實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）取出瓊脂板，在0.5%考馬斯亮藍(lán)中染色，6%醋酸脫色。6.從加樣孔的圓心到峰尖量取各孔樣品沉淀峰的高度。以抗原濃度為橫坐標(biāo),峰高為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中抗原的含量。瓊脂糖雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)原理：將Ag與Ab兩種溶液置于瓊脂糖凝膠的不同位置，使兩者都在凝膠中自由擴(kuò)散，抗原與抗體相遇并在比例合適處形成可見的乳白色沉淀線。沉淀線的數(shù)目、位置、形狀等，與抗原或抗體的純度、濃度、擴(kuò)散速度等有關(guān)。實(shí)驗(yàn)流程

鋪制瓊脂糖凝膠板

打孔(梅花形)

加入樣品(中心孔內(nèi)加入抗IgG血清,其余加入待檢血清，37c，24h）。DoubleImmunodifusion實(shí)驗(yàn)步驟

將已溶化的1%生理鹽水瓊脂糖3-4ml傾注在玻片上制成厚薄均勻的凝膠板。待凝固后，打梅花孔（如下圖）。在中心孔內(nèi)用加樣器加入10

lanti-IgG血清（抗體）。在第1-5孔內(nèi)分別加入10

l經(jīng)系列倍比稀釋：

1:32，1:16，1:8，1:4，1:2的待測(cè)血清樣品（IgG），在第6孔內(nèi)加入生理鹽水對(duì)照。243165實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）

4.將凝膠板放濕盒中，37

c，24h后觀察結(jié)果，以出現(xiàn)明顯沉淀線的最大稀釋的抗體孔為終點(diǎn)孔，終點(diǎn)孔中抗體的稀釋倍數(shù)（最高稀釋度）即為該待測(cè)血清IgG的效價(jià)。243165凝集反應(yīng)(agglutination)

原理：顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合→肉眼可見的凝集物；方法：直接凝集、間接凝集、間接凝集抑制試驗(yàn)直接凝集試驗(yàn)-血型鑒定

血型抗原：紅細(xì)胞表面的同種異型抗原人類紅細(xì)胞表面A、B抗原不同：A、B、AB、O血型同一人血清中不含與本人血型抗原相應(yīng)的抗體

表型 血型抗原 檢測(cè)抗體 A型 A 抗AB型 B 抗BAB型 AB －O型 H 抗A抗B

2023/12/724SameAginbothwells=>fused&continuouslineUnrelatedAgsinseparatewells=>bandscrosseachotherRelatedAgsinseparatewells=>partialidentityProspectiveResultofDoubleImmunodiffusion2023/12/725Sam