綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達課件

綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達概覽和實驗內容實驗目的實驗原理實驗過程綠色熒光蛋白(,簡稱)基因來源于，是等于年發(fā)現的蛋白質，由個氨基酸組成，分子量約為。在包括熱、極端和化學變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定在熒光顯微鏡下，用波長約的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢出率；蛋白本身性質穩(wěn)定；可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；其基因片段長度較小(約)，易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性是一種優(yōu)化的突變型，使其產生的熒光較普通強倍，大大增強了其報告基因的敏感度。與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子。絲氨酸－酪氨酸－甘氨酸生色基團蛋白質折疊，生色基團得以“親密接觸”,經環(huán)化形成咪唑酮,并發(fā)生脫水反應。但此時還不能發(fā)射熒光,只有當有分子氧存在的條件下,發(fā)生氧化脫氫,方能導致綠色熒光蛋白發(fā)色團的“成熟”,形成可發(fā)射熒光的形式。藍光、綠光與黃光基因克隆變體分子標記藥物篩選融合抗體生物傳感器信號傳導標記！真核細胞表達載體，載體上攜帶有蛋白表達基因很強的復制能力高效的功能強大的啟動子和多克隆位點具有基因，可以采用來篩選已成功轉染了該載體的靶細胞系統(tǒng)（）原核蛋白表達引用最多的系統(tǒng)在任何表達系統(tǒng)中，基礎表達水平最低真正的調節(jié)表達水平的“變阻器”控制提供各種不同融合標簽和表達系統(tǒng)配置具有可溶性蛋白生產、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌許多載體以載體試劑盒方式提供，用于迅速定向克隆產物許多宿主菌株以感受態(tài)細胞形式提供，可立即用于轉化（）表達菌株表達載體和宿主菌的選擇（）是表達宿主菌實驗內容得到重組質粒轉入表達菌株（）經培養(yǎng)后用進行三個時間梯度的誘導表達，紫外線下觀察實驗目的掌握重組蛋白的基因表達和蛋白檢測設計思想學習分子生物學實驗主要操作技術實驗原理實驗器材與儀器實驗儀器實驗材料實驗試劑實驗思路實驗步驟將重組質粒轉化入表達菌株·制備（）菌株的感受態(tài)細胞

（）菌液接入液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過夜二次活化：比例接入新的試管搖床培養(yǎng)冰上度，離心收集細胞棄培養(yǎng)液，加入預冷的液，輕懸，冰上，度，離心棄上清液，加入預冷的液，輕懸，冰上，度，離心棄上清液，加入預冷的液，輕懸，即可·將重組質粒轉入（）菌中分成份，份分別加入重組質粒，輕勻，冰上；份平行操作（對照）度水浴熱擊，迅速冰上冷卻兩管中分別加入液體培養(yǎng)基，勻，度振蕩培養(yǎng)涂平板：）分別取、、加入重組質粒的感受態(tài)細胞懸液涂布于含抗生素的平板）抗生素板重組質粒的感受態(tài)細胞懸液）對照組感受態(tài)細胞抗生素平板）正面向上放置片刻，后度倒置培養(yǎng)誘導重組蛋白的表達重組陽性克隆菌接至（）液體培養(yǎng)基中，度培養(yǎng)過夜菌比例接種至支試管中（每支試管含()），擴大培養(yǎng)，測量值為，停止分別使用