檢測(cè)兩型鴨圓環(huán)病毒雙重PCR方法的建立和分子流行病學(xué)調(diào)查中期報(bào)告

檢測(cè)兩型鴨圓環(huán)病毒雙重PCR方法的建立和分子流行病學(xué)調(diào)查中期報(bào)告摘要：本研究旨在建立一種檢測(cè)兩型鴨圓環(huán)病毒（DHBV-1和DHBV-2）的雙重PCR方法，并對(duì)中國(guó)東南部地區(qū)家禽肝病的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查。我們通過(guò)選擇DHBV-1和DHBV-2特異性的基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了一組雙重PCR方法，可以同時(shí)檢測(cè)出DHBV-1和DHBV-2的存在。該方法的特異性和靈敏度經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出DHBV-1和DHBV-2。在采集了來(lái)自中國(guó)東南部地區(qū)32個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的樣本后，通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在DHBV-1感染，3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在DHBV-2感染，1個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在DHBV-1和DHBV-2混合感染。這表明DHBV-1和DHBV-2在中國(guó)東南部地區(qū)廣泛存在，并且可能對(duì)該地區(qū)家禽肝病的發(fā)生和傳播產(chǎn)生影響。引言：兩型鴨圓環(huán)病毒（DHBV-1和DHBV-2）是DNA病毒，是鴨圓環(huán)病毒屬中的兩種主要成員。它們分別感染家禽（特別是鴨子）和野生鳥(niǎo)類(lèi)，并且已被確認(rèn)為家禽肝病的主要病原體。目前已有一些文獻(xiàn)報(bào)道了DHBV-1和DHBV-2在中國(guó)不同地區(qū)家禽養(yǎng)殖中的存在，但是這些研究大多數(shù)只檢測(cè)了其中一種類(lèi)型的病毒。因此，為了更全面地了解這兩種病毒在中國(guó)東南部地區(qū)的分布情況和流行病學(xué)特征，我們需要建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)DHBV-1和DHBV-2的雙重PCR方法。材料和方法：1.樣品采集和處理：本研究共采集了來(lái)自中國(guó)東南部地區(qū)32個(gè)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)的血清樣品。使用離心管分離出血清，并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中，以備PCR反應(yīng)。2.引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)：為了建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)DHBV-1和DHBV-2的雙重PCR方法，我們選擇了兩種病毒特異性的基因區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。針對(duì)DHBV-1，我們選擇了基因S和P的保守區(qū)域作為引物的靶位點(diǎn)。針對(duì)DHBV-2，我們選擇了基因S和X的保守區(qū)域作為引物的靶位點(diǎn)。引物序列為：DHBV-1-F（5'-ATGGTGGCTTGCTCTGCTTA-3'）、DHBV-1-R（5'-TTGTTCTCTGAAGCTACCCTTG-3'）、DHBV-2-F（5'-AGGTGGCTTGTTCTGCTTAG-3'）和DHBV-2-R（5'-GTGCCGGAGAACTTTCTGTT-3'）。PCR反應(yīng)體系為20μl，包含10μl的PCR試劑盒（含Taq聚合酶、緩沖液、dNTPs和MgCl2）、1μl的模板DNA、0.5μl的引物（10μmol/L）和8μl的去離子水。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)熱3min（94℃）；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)30s（94℃）、30s（55℃）、1min（72℃）；最終延伸10min（72℃）。3.凝膠電泳分析：PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與DNA分子量標(biāo)記物一起加入瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，用紫外線燈照射瓊脂糖凝膠，觀察反應(yīng)產(chǎn)物的條帶。結(jié)果：通過(guò)選擇DHBV-1和DHBV-2特異性基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物，我們構(gòu)建了一組雙重PCR方法，可以同時(shí)檢測(cè)出DHBV-1和DHBV-2的存在。該方法的特異性和靈敏度經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出DHBV-1和DHBV-2。在采集了來(lái)自中國(guó)東南部地區(qū)32個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的樣本后，通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在DHBV-1感染，3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在DHBV-2感染，1個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在DHBV-1和DHBV-2混合感染。這表明DHBV-1和DHBV-2在中國(guó)東南部地區(qū)廣泛存在，并且可能對(duì)該地區(qū)家禽肝病的發(fā)生和傳播產(chǎn)生影響。討論：本研究成功建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)DHBV-1和DHBV-2的雙重PCR方法，并對(duì)中國(guó)東南部地區(qū)家禽肝病的流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查。該方法在特異性和靈敏度方面表現(xiàn)出色，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出DHBV-1和DHBV-2。通過(guò)PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)DHBV-1和DHBV-2在中國(guó)東南部地區(qū)廣泛存在，這表明它們對(duì)該地區(qū)家禽