土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)公開課

專題2:微生物的培養(yǎng)與應用課題2土壤中分解尿素的細菌的別離與計數(shù)1整理ppt課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農業(yè)氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌能利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH32整理ppt3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中別離出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設置對照3整理ppt1、實例：PCR技術啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈式反響是一種在體外將少量DNA大量復制(PCR)的技術，此項技術要求使用耐高溫〔930C〕的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株4整理ppt要別離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；方法：⑴抑制大多數(shù)微生物的生長⑵促進目的菌株的生長結果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純化培養(yǎng)別離。2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。5整理ppt15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌的別離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基6整理ppt②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理7整理ppt允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基8整理ppt5、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是別離尿素細菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結果只生長尿素細菌生長多種微生物是9整理ppt1、顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板(血細胞計數(shù)板〕，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點：10整理ppt2.間接計數(shù)法〔活菌計數(shù)法〕⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。11整理ppt？說明設置重復組的重要性。在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結果時，一定要考慮所設置的重復組的結果是否一致，結果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。12整理ppt本卷須知①為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。13整理ppt實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。⑴土樣不同⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。假設一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗假設二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，那么證明A無誤；如果結果不同，那么證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。如何驗證?14整理ppt〔三〕設置對照①判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。②判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：完全培養(yǎng)基〔營養(yǎng)成分齊全〕接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。

主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。15整理ppt從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。“微生物的天然培養(yǎng)基〞[一]土壤取樣數(shù)量最大、種類最多大約70%—90%是細菌◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。16整理ppt[二]制備培養(yǎng)基

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。

可準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。17整理ppt◆應在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進行◆別離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板〔三〕 樣品的稀釋18整理ppt問題：為什么別離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量〔單位：株/kg〕是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行別離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。19整理ppt㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅酥辽?個菌落數(shù)目在30——300的平板，那么說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，說明試驗不精確，需要重新實驗。20整理ppt㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因培養(yǎng)時間缺乏而導致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d

放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d

霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。21整理ppt微生物的培養(yǎng)與觀察菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色22整理ppt23整理ppt操作提示[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時間

三、24整理ppt四、課題成果與評價

培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。25整理ppt1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中參加酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。五.課外延伸CO〔NH2〕2+H