微生物的生長繁殖及其控制

第五章微生物的營養(yǎng)1整理課件二、微生物的營養(yǎng)要素六要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水營養(yǎng)物質(zhì)按照它們在機體中的生理作用不同，可以將它們區(qū)分成六大類。功能:參與微生物細胞的組成提供微生物機體進行各種生理活動所需的能量形成微生物代謝產(chǎn)物的來源

2整理課件一、碳源(carbonsource)提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)源。有機碳源：蛋白質(zhì)，核酸，淀粉，葡萄糖等無機碳源：CO2,Na2CO3,CaCO3等

異養(yǎng)微生物：必須利用有機碳源自養(yǎng)微生物：能利用無機碳源對于為數(shù)眾多的化能異養(yǎng)微生物來說，碳源是兼有能源功能營養(yǎng)物。3整理課件微生物可利用的碳源糖類：葡萄糖，果糖，麥芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖，纖維二糖，纖維素，半纖維素，甲殼素，木質(zhì)素，等有機酸：乳酸，檸檬酸，延胡索酸，低級脂肪酸，高級脂肪酸，氨基酸，等醇類：乙醇，等脂類：脂肪，磷脂，等烴類：天然氣，石油，石油餾分，石蠟油，等CO2碳酸鹽：NaHCO3,CaCO3,白堊，等其他：芳香族化合物，氰化物，蛋白質(zhì)，肽，核酸4整理課件目前在微生物發(fā)酵工業(yè)中，常根據(jù)不同微生物的需要，利用各種農(nóng)副產(chǎn)品如玉米粉、米糠、麥麩、馬鈴薯、甘薯以及各種野生植物的淀粉，作為微生物生產(chǎn)廉價的碳源。這類碳源往往包含了幾種營養(yǎng)要素。

5整理課件二、氮源(nitrogensource)凡能提供微生物營養(yǎng)所需氮元素的營養(yǎng)源。氮源一般不作能源。有機氮源：蛋白胨、黃豆粉、玉米漿無機氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4、N2微生物細胞中大約含氮5％～13％，它是微生物細胞蛋白蛋和核酸的主要成分。6整理課件銨鹽和氨基酸被微生物吸收后能直接被利用NO3－和蛋白質(zhì)吸收后還需復原降解才可利用速效氮源遲效氮源7整理課件

實驗室常用的氮源有硝酸銨、硫酸銨、尿素、碳酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、黃豆粉、玉米漿等。8整理課件三、能源(energysource)能為微生物的生命活動提供最初能量來源的化學物質(zhì)或輻射能。異養(yǎng)微生物的碳源同時也是能源無機物：化能自養(yǎng)微生物的能源能源譜化學物質(zhì)輻射能：光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)微生物的能源有機物：化能異養(yǎng)微生物的能源9整理課件四、生長因子(growthfactor)

一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳源，氮源自行合成的、所需極微量的有機物。生長因子主要是維生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶等特殊有機營養(yǎng)物。10整理課件主要功能是提供微生物細胞重要的化學物質(zhì)，作為酶的輔基或輔酶參與代謝。在自然界中自養(yǎng)型細菌和大多數(shù)腐生細菌、霉菌都能自己合成許多生長輔助物質(zhì)，不需要另外供給就能正常生長發(fā)育。

不能合成因子的，添加方式是在培養(yǎng)基中加酵母膏、豆芽汁、玉米漿、肝臟浸出液或組織提取液等。11整理課件五、無機鹽(inorganicsalts)所需濃度在10-3--10-4M的元素為大量元素

所需濃度在10-6--10-8M的元素為微量元素微生物生長需要多種礦質(zhì)元素，如磷、硫、鎂、鉀、鈣、鈉、鐵、硼、錳、銅、鋅、鉬等。12整理課件無機鹽的生理功能無機鹽大量元素微量元素一般功能特殊功能細胞內(nèi)一般分子成分(P、S、Ca、Mg、Fe等)生理調(diào)節(jié)物質(zhì)滲透壓的維持(Na+等)酶的激活劑(Mg等)pH的穩(wěn)定化能自養(yǎng)菌的能源(S、Fe2+、NH4+、MO2-等)無氧呼吸時的氫受體(NO3-、SO42-等)酶的激活劑(Cu2+、Mn2+、Zn2+等)特殊分子結構成分(Co、Mo等)13整理課件六、水存在狀態(tài)：游離態(tài)〔溶劑〕和結合態(tài)〔結構組成〕生理作用：細胞組成成分生化反響溶劑化學、生理反響介質(zhì)物質(zhì)運輸媒體調(diào)節(jié)細胞溫度維持細胞的滲透壓14整理課件微生物的營養(yǎng)類型

營養(yǎng)類型能源碳源實例光能自養(yǎng)型光能CO2藍細菌紫硫細菌綠硫細菌藻類光能異養(yǎng)型光能CO2及簡單有機物紅螺細菌化能自養(yǎng)型無機物CO2硝化細菌硫化細菌鐵細菌氫細菌化能異養(yǎng)型有機物有機物絕大多數(shù)微生物，原生動物15整理課件1．光能自養(yǎng)型能以CO2為主要唯一或主要碳源進行光合作用獲取生長所需要的能量以無機物如H2、H2S、S等作為供氫體或電子供體，使CO2復原為細胞物質(zhì)例如，藻類及藍細菌等和植物一樣，以水為電子供體〔供氫體〕，進行產(chǎn)氧型的光合作用，合成細胞物質(zhì)。而紅硫細菌，以H2S為電子供體，產(chǎn)生細胞物質(zhì)，并伴隨硫元素的產(chǎn)生。16整理課件2．光能異養(yǎng)型不能以CO2為主要或唯一的碳源以有機物作為供氫體，利用光能將CO2復原為細胞物質(zhì)在生長時大多數(shù)需要外源的生長因子例如，紅螺菌屬中的一些細菌能利用異丙醇作為供氫體，將CO2復原成細胞物質(zhì)，同時積累丙酮。17整理課件3．化能自養(yǎng)型生長所需要的能量來自無機物氧化過程中放出的化學能以CO2或碳酸鹽作為唯一或主要碳源進行生長時，利用H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等作為電子供體使CO2復原成細胞物質(zhì)?；軣o機自養(yǎng)型只存在于微生物中，可在完全無機及無光的環(huán)境中生長。它們廣泛分布于土壤及水環(huán)境中,參與地球物質(zhì)循環(huán)18整理課件4．化能異養(yǎng)型生長所需要的能量均來自有機物氧化過程中放出的化學能生長所需要的碳源主要是一些有機化合物，如淀粉、糖類、纖維素、有機酸等。大多數(shù)細菌、真菌、原生動物都是化能有機異養(yǎng)型微生所有致病微生物均為化能有機異養(yǎng)型微生物19整理課件不同營養(yǎng)類型之間的界限并非絕對異養(yǎng)型微生物并非絕對不能利用CO2；自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機物進行生長；有些微生物在不同生長條件下生長時,其營養(yǎng)類型也會發(fā)生改變；例如紫色非硫細菌(purplenonsulphurbacteria)：沒有有機物時：同化CO2，為自養(yǎng)型微生物；有機物存在時：利用有機物進行生長，為異養(yǎng)型微生物；光照和厭氧條件下：利用光能生長，為光能營養(yǎng)型微生物；黑暗與好氧條件下：依靠有機物氧化產(chǎn)生的化學能生長，為化能營養(yǎng)型微生20整理課件

原生質(zhì)膜是一種半透性膜，營養(yǎng)物質(zhì)通過原生質(zhì)膜上的小孔，由高濃度的胞外環(huán)境向低濃度的胞內(nèi)進行擴散。一、單純擴散(simplediffusion)21整理課件依靠胞內(nèi)外溶液濃度差，順濃度梯度運輸；不消耗代謝能，無特異性；運輸氧、二氧化碳、甘油、乙醇、某些氨基酸等小分子；運輸速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比特點22整理課件物質(zhì)跨膜擴散的能力和速率與該物質(zhì)的性質(zhì)有關,分子量小、脂溶性、極性小的物質(zhì)易通過擴散進出細胞。水是唯一可以通過擴散自由通過原生質(zhì)膜的分子，脂肪酸、乙醇、甘油、一些氣體〔O2、CO2〕及某些氨基酸在一定程度上也可通過自由擴散進出細胞。擴散并不是微生物細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要方式.23整理課件二、促進擴散(facilitateddiffusion)利用膜內(nèi)、膜外被運輸物質(zhì)和載體蛋白的親和力的不同。被動的物質(zhì)跨膜運輸方式.載體只影響物質(zhì)的運輸速率，并不改變該物質(zhì)在膜內(nèi)外形成的動態(tài)平衡狀態(tài)；特點：參與運輸?shù)奈镔|(zhì)本身的分子結構不發(fā)生變化需要特異性的載體蛋白順濃度梯度運輸不消耗能量運輸硫酸根、磷酸根、糖〔真核〕24整理課件載體蛋白(carrierprotein):載體蛋白需要同被運輸?shù)碾x子和分子結合,然后通過自身的構型變化或移動完成物質(zhì)運輸?shù)哪さ鞍住＜赐感悦浮⒁莆幻浮泊蠖嗤ㄟ^誘導產(chǎn)生〕有物特異性每種載體蛋白運輸相應的物質(zhì)可加快運輸速度，但不能逆濃度運輸25整理課件

通過促進擴散進入細胞的營養(yǎng)物質(zhì)主要有氨基酸、單糖、維生素及無機鹽等。一般微生物通過專一的載體蛋白運輸相應的物質(zhì)，但也有微生物對同一物質(zhì)的運輸由一種以上的載體蛋白來完成。促進擴散常見于真核微生物。26整理課件3、主動運輸(activetransport)特點：是微生物吸收營養(yǎng)的主要方式可逆濃度梯度運輸，耗能需載體蛋白，有特異性運輸有機離子、無機離子、氨基酸、乳糖等糖類需要特異性載體蛋白需要能量來改變載體蛋白的構象

27整理課件4、基團轉(zhuǎn)位(grouptranslocation)特點：屬主動運輸類型〔有一個復雜的運輸系統(tǒng)來完成物質(zhì)的運輸，而物質(zhì)在運輸過程中發(fā)生化學變化〕溶質(zhì)分子發(fā)生化學修飾運輸葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等每輸入一個葡萄糖分子，就要消耗一個ATP的能量。28整理課件

基團轉(zhuǎn)移主要存在于厭氧型和兼性厭氧型細胞中，主要用于糖的運輸，脂肪酸、核苷、堿基等也可以通過這種方式運輸。29整理課件四種運送營養(yǎng)方式的比較比較工程單純擴散 促進擴散主動運輸基團移位特異載體蛋白無 有 有 有 運送速度 慢 快 快 快 溶質(zhì)運送方向由濃至稀由濃至稀 由稀至濃 由稀至濃平衡時內(nèi)外濃度內(nèi)外相等 內(nèi)外相等 內(nèi)部高 內(nèi)部高 運送分子 無特異性 特異性 特異性 特異性 能量消耗 不需要 不需要 需要 需要 運送前后溶質(zhì)分子不變 不變 不變 改變 載體飽和效應 無 有 有 有 運送對象舉例水、O2糖、SO42-氨基酸、乳糖葡萄糖\嘌呤30整理課件第四節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)基是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。任何培養(yǎng)基都應該具備微生物生長所需要六大營養(yǎng)要素碳源、氮源、無機鹽、能源、生長因子、水31整理課件二、選擇和配制培養(yǎng)基的原那么和方法〔一〕四個原那么1、目的明確〔根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基〕培養(yǎng)什么微生物、獲得什么產(chǎn)物、用途2、營養(yǎng)協(xié)調(diào)

營養(yǎng)協(xié)調(diào)(注意營養(yǎng)物的濃度和配比，特別是碳氮比C/N比)32整理課件C/N比:微生物培養(yǎng)基中所含的碳源中的碳原子與氮源中氮原子的摩爾數(shù)之比。不是簡單的某碳源的重量與氮源的重量之比。因為，不同種類的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量差異很大。33整理課件3、物理化學條件適宜pH滲透壓和水活度氧化復原電位34整理課件滲透壓:高濃度溶液向低濃度溶液滲透時，其溶質(zhì)分子所產(chǎn)生的壓力。高滲溶液會導致微生物細胞發(fā)生質(zhì)壁別離低滲溶液會導致微生物細胞吸水膨脹甚至破裂35整理課件用水活度(wateractivity,aw)表示aw：在天然環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水含量。aw=P/PoP:溶液的蒸汽壓

Po:純水的蒸汽壓在常溫常壓下，純水的aw為1.00微生物一般在αw為0.60～0.99的條件下生長36整理課件氧化復原電位Eh：氧化復原系統(tǒng)中的復原劑釋放電子或氧化劑接受電子的趨勢。好氧微生物：＞+0.1V一般+0.3~+0.4V厭氧微生物：+0.1V以下兼性微生物：+0.1V以上好氧呼吸+0.1V以下進行發(fā)酵37整理課件pH：微生物有最正確生長pH

細菌:pH7.0~8.0放線菌：pH7.0~8.5

酵母菌:pH3.8~6.0霉菌：pH4.0~6.038整理課件微生物在生長過程中培養(yǎng)基pH值可能發(fā)生的變化：在含糖基質(zhì)上生長,會產(chǎn)酸而使pH下降，在分解蛋白質(zhì)和氨基酸時,會產(chǎn)NH3而使pH上升，以(NH4)2SO4作N源,會過剩SO42-,而使pH下降，分解利用陽離子化合物如：NaNO3,會過剩Na+而使pH上升。39整理課件4、原料來源的選擇以粗代精以野代家以廢代好以國代進以簡代繁以氮代朊以烴代糧以纖代糖40整理課件滅菌處理高壓蒸汽滅菌：121℃，15～20min高溫滅菌對營養(yǎng)物質(zhì)的破壞及pH變化41整理課件設計方法生態(tài)模擬模擬自然生長條件，利用自然基質(zhì)參閱文獻

精心設計試驗比較由定性到定量、由小到大、由實驗室到工廠規(guī)模逐步擴大。42整理課件培養(yǎng)基類型根據(jù)培養(yǎng)基成分：天然培養(yǎng)基指一些利用動、植物或微生物體或其提取物制成的培養(yǎng)基，成分未知。如培養(yǎng)細菌所用的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基等。

優(yōu)點：取材方便、營養(yǎng)豐富、種類多樣、配制方便43整理課件組合培養(yǎng)基是一類用多種高純化學試劑配制的、各成分〔包含微量元素〕的量都確切知道的培養(yǎng)基。如培養(yǎng)細菌所用的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌的淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基〔高氏一號〕。較昂貴，一般用于研究工作〔代謝、遺傳分析〕優(yōu)點：組份精確、重復性好半組合培養(yǎng)基44整理課件按目的不同劃分種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基繁殖培養(yǎng)基保藏培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富。尤其是氮源含量高，即碳氮比值低發(fā)酵培養(yǎng)基，它的氮源一般應比種子培養(yǎng)基稍低；假設發(fā)酵產(chǎn)物為含氮化合物時，有時還提高培養(yǎng)基中氮源含量45整理課件按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)：固體、半固體、液體、脫水。固體培養(yǎng)：一般加有凝固劑，凝固劑含量一般為1.5～2％凝固劑的條件：不被微生物分解利用，生長溫度范圍內(nèi)保持固體狀態(tài)，凝固點溫度對微生物無害，不因滅菌而破壞，透明度好、配制方便、價格低。常用的為瓊脂與明膠?？捎糜冢壕N別離、鑒定、保藏等。46整理課件半固體培養(yǎng)基，凝固劑含量一般約為0.5%,用途：觀察細菌的運動液體培養(yǎng)基:培養(yǎng)基中沒有凝固劑。用途：大量培養(yǎng)微生物，研究生理代謝等。脫水培養(yǎng)基:商品培養(yǎng)基47整理課件依功能不同：選擇培養(yǎng)基(Selectedmedium)：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養(yǎng)基。功能：混合菌中劣勢菌變成優(yōu)勢菌，從而提高該菌的篩選效率鑒別培養(yǎng)基(Differentialmedium)：參加能與某一菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生反響的指示劑，從而用肉眼就能使該菌落與外形相似的其他菌落相區(qū)分的培養(yǎng)基。用途：細菌學檢驗遺傳研究，48整理課件第六章

微生物的生長及其控制

49整理課件單位時間里微生物數(shù)量或生物量〔Biomass〕的變化微生物生長：微生物生長測量方法個體計數(shù)法重量法生理指標法50整理課件1總細胞計數(shù)法1〕血球計數(shù)板法缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動菌的計數(shù)；需要相對高的菌濃度；只適用于酵母菌和霉菌的孢子一、個體計數(shù)法〔一〕直接法51整理課件2〕涂片計數(shù)法將體積的待測樣品均勻的涂在載玻片的面積上，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下選擇假設干視野計算細胞的數(shù)量。視野的面積可用鏡臺測微尺測得直徑并計算出來。52整理課件〔二〕間接計數(shù)法1.活菌計數(shù)法1〕涂布平板法2〕澆注平板法53整理課件采用培養(yǎng)平板計數(shù)法要求操作熟練、準確，否那么難以得到正確的結果：樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液；同一稀釋度三個重復,取平均值；每個平板上的菌落數(shù)目適宜，便于準確計數(shù)；一個菌落可能是多個細胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位〔colonyformingunits，CFU〕來表示，而不是直接表示為細胞數(shù)。54整理課件當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，對形成的菌落進行統(tǒng)計。膜過濾培養(yǎng)法55整理課件2、比濁法56整理課件二、重量法收集微生物菌體，或?qū)⑽⑸锱囵B(yǎng)液離心，收集細胞沉淀物，然后稱重。1.濕重法收集微生物菌體，或?qū)⑽⑸锱囵B(yǎng)液離心，收集細胞沉淀物，然后稱重。2.干重法將微生物菌體或離心得到的細胞沉淀物置100—105℃的烘箱中枯燥至水份去除，然后再稱重。3.通過樣品中蛋白質(zhì)、核酸含量的測定間接推算微生物群體的生物量；57整理課件3.生理指標測定法樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設備來測定相應的指標。常用于對微生物的快速鑒定與檢測微生物的生理指標，如呼吸強度，耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關。58整理課件三、細菌群體生長規(guī)律在不補充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個培養(yǎng)液體積不變條件下，以時間為橫坐標，以菌數(shù)為縱坐標，根據(jù)不同培養(yǎng)時間時細菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。生長曲線第二節(jié)微生物的生長59整理課件60整理課件1〕延滯期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。也稱延遲期、適應期。延滯期特點?生長速常數(shù)為零?細胞形態(tài)變大或增長細胞內(nèi)的RNA尤其是rRNA含量增高合成代謝十分活潑對外界不良因素反響敏感61整理課件緩慢期出現(xiàn)的原因：微生物接種到一個新的環(huán)境，暫時缺乏分解和催化有關底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應期。62整理課件影響延滯期長短的因素接種齡:對數(shù)期“種子〞，延滯期較短；延滯期或衰亡期“種子〞,延滯期較長；接種量：接種量大，延滯期較短；接種量小，延滯期較長；培養(yǎng)基成分:培養(yǎng)基成分豐富的,延滯期較短；培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基一致,延滯期較短；

63整理課件縮短延滯期措施：①通過遺傳學方法改變種的遺傳特性使緩慢期縮短；②利用對數(shù)生長期的細胞作為“種子〞；③盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；④適當擴大接種量等方式縮短緩慢期，克服不良的影響。64整理課件2〕指數(shù)期特點?生長速率常數(shù)R最大?細胞進行平衡生長酶系活潑，代謝旺盛65整理課件影響指數(shù)期的因素

菌種：不同菌種的代時差異極大

營養(yǎng)成分：營養(yǎng)越豐富，代時越短

營養(yǎng)物濃度：影響微生物的生長速率和總生長量

培養(yǎng)溫度：影響微生物的生長速率66整理課件是代謝、生理研究的良好材料是增殖噬菌體的最適宿主菌齡是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子〞的最正確種齡G+染色鑒定時采用此期微生物指數(shù)期的實踐意義67整理課件3〕穩(wěn)定期特點：1生長速率常數(shù)R等于02菌體產(chǎn)量到達了最高值3合成次生代謝產(chǎn)物4細胞內(nèi)出現(xiàn)儲藏物質(zhì)，芽孢菌內(nèi)開始產(chǎn)生芽孢

68整理課件產(chǎn)生原因：營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不適宜有害代謝廢物的積累〔酸、醇、毒素等〕物化條件〔pH、氧化復原勢等〕不適宜通過補充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對好氧菌進行通氣、攪拌或振蕩等獲得更多的代謝產(chǎn)物69整理課件穩(wěn)定期的實踐意義是發(fā)酵生產(chǎn)中以獲得菌體或代謝產(chǎn)物為目的的最正確收獲期；導致了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝技術的改進。70整理課件4〕衰亡期特點：1R為負值2細胞的形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)不規(guī)那么的衰退形3釋放次生代謝產(chǎn)物，芽孢等4有的菌體開始自溶71整理課件〔1〕繁殖代數(shù)〔n〕指數(shù)生長方式：1248……2n設接種時細胞數(shù)為B0,時間為t1,到時間t2后，繁殖n代，細胞數(shù)為Bt，它們之間的相互關系為：Bt=B0*2n以對數(shù)表示：lgBt=lgB0+nlg2n=lgBt-lgB0=lgBt-lgB0lg20.30172整理課件世代：由1個細胞分裂成為2個細胞的間隔被稱為世代。代時：就是一個世代所需的時間，因而也就是群體細胞數(shù)目擴大1倍所需的時間，有時也被稱為倍增時間。

代時〔G)=tn73整理課件五、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。連續(xù)培養(yǎng)的根本原那么：微生物培養(yǎng)過程中不斷的補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)類型恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒化連續(xù)培養(yǎng)74整理課件(一)恒化連續(xù)培養(yǎng)在整個培養(yǎng)過程中通過控制培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度根本恒定的方式，保持細菌的比生長速率恒定，使生長“不斷〞進行。生長速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，生長因子等物質(zhì)

恒化器連續(xù)培養(yǎng)通常用于微生物學的研究，篩選不同的變種。75整理課件(二)恒濁連續(xù)培養(yǎng)通過連續(xù)培養(yǎng)裝置中的光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細菌生長連續(xù)進行的一種培養(yǎng)方式76整理課件第三節(jié)

環(huán)境因素對微生物生長的影響一、溫度根據(jù)微生物生長的最適溫度不同，可以將微生物分為嗜冷、兼性嗜冷、嗜溫、嗜熱和超嗜熱等五種不同的類型。它們都有各自的最低、最適和最高生長溫度范圍。77整理課件微生物類型生長溫度／℃最低最適最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜溫微生物15-2020-4545以上嗜熱微生物4555-6580超嗜熱或嗜高溫微生物6580-90100以上78整理課件(二)PH微生物生長過程中機體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反響是酶促反響，而酶促反響都有一個最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應速率最高，微生物生長速率最大，因此微生物生長也有一個最適生長的pH范圍。79整理課件微生物最低PH最適PH最高PH細菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8嗜中性微生物生長的pH范圍是pH5.—8.0，最適生長pH近中性〔pH7.0〕。大多數(shù)細菌屬于嗜中性微生物。嗜酸性微生物最適生長pH在5.5以下生長的微生物稱之為嗜酸性微生物。嗜堿性微生物生長的pH范圍是pH7.0—11.5，最適生長pH在8.0以上。80整理課件(三)氧好氧微好氧耐氧型兼性厭氧專性厭氧微生物類型最適生長的O2體積分數(shù)好氧微好氧氧的忍耐型兼性厭氧專性厭氧等于或大于20％2％一l0％2％以下有氧或無氧不需要氧、有氧時死亡81整理課件一、微生物純培養(yǎng)的別離純化自然環(huán)境如土壤和水中，通常棲息著的是許多不同微生物混雜在一起的群體。哪怕是一粒砂或塵土，也常含有多種細菌及其它微生物。研究微生物生長通常采用微生物純培養(yǎng)。微生物學中將在實驗條件下從一個單細胞繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng)。第四節(jié)微生物微生物培養(yǎng)法概論

82整理課件平板劃線別離法稀釋倒平板法單孢子或單細胞別離法利用選擇性培養(yǎng)基別離法83整理課件1、稀釋倒平板法84整理課件85整理課件2、平板劃線法進行純化用接種環(huán)以菌操作沾取少許待別離的材料，在無菌平板外表進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板外表得到單菌落。86整理課件87整理課件3、單孢子或單細胞別離法采取顯微別離法從混雜群體中直接別離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。在顯微鏡下使用單孢子別離器進行機械操作，挑取單孢子或單細胞進行培養(yǎng)。也可以采用特制的毛細管在載玻片的瓊脂涂層上選取單孢子并切割下來，然后移到適宜的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。88整理課件4、選擇性培養(yǎng)基別離法各種微生物對不同的化學試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制適宜某種微生物而限制其它微生物生長的選擇培養(yǎng)基，用它來培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。89整理課件微生物純培養(yǎng)別離方法的比較分離方法應用范圍平皿劃線法方法簡便，多用于分離細菌稀釋倒平皿法即可定性，又可定量，用途廣泛單細胞挑取法局限于高度專業(yè)化的科學研究利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類型較特殊的90整理課件二、微生物的培養(yǎng)方法根據(jù)氧氣的需要與否分為兩大類：好氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)

根據(jù)培養(yǎng)基的物理特性分為兩大類：固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)

91整理課件〔一〕好氧培養(yǎng)方法瓊脂斜面和瓊脂平皿培養(yǎng)1〕固體好氧培養(yǎng)方法92整理課件2〕液體好氧培養(yǎng)方法恒溫振蕩培養(yǎng)箱93整理課件實驗室小型全自動發(fā)酵罐94整理課件95整理課件〔二〕厭氧培養(yǎng)方法微生物厭氧培養(yǎng)箱！96整理課件第四節(jié)微生物生長的控制滅菌〔sterilization〕:采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施消毒(disinfection):采用較溫和的理化因素，僅殺死物體外表或內(nèi)部的病原菌，而對被消毒對象根本無害的措施；防腐(antisepsis):利用某種理化因素抑制霉腐微生物生長繁殖，防止食品等發(fā)生霉變的措施?；?chemotherapy)：利用對病原菌具有高毒力而對宿主根本無毒的化學物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖。97整理課件一、物理控制方法(一)高溫滅菌高壓蒸汽滅菌的溫度越高，微生物死亡越快。通常情況下溫度為121℃。

衡量滅菌效果的指標十倍致死時間：即在一定的溫度條件下，微生物數(shù)量十倍減少所需要的時間。熱致死時間：即在一定溫度下殺死所有某一濃度微生物所需要的時間98整理課件②干熱滅菌干熱滅菌烘箱內(nèi)熱空氣滅菌火焰灼燒溫度：150-170℃；時間：1-2h對象：金屬器械、玻璃器皿等99整理課件③煮沸消毒將待消毒物品如注射器、金屬用具、解剖用具等在水中煮沸15min或更長時間，以殺死細菌或其他微生物的營養(yǎng)體和少局部的芽孢或孢子。3類濕熱滅菌法————100整理課件④間隙滅菌法對于某些培養(yǎng)基，由于高壓蒸汽滅菌會破壞某些營養(yǎng)成分，可用間隙滅菌法滅菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反復滅菌幾次。例如第一次蒸煮后殺死微生物營養(yǎng)體，冷卻，培養(yǎng)過夜，孢子萌發(fā)，又第二次蒸煮，殺死營養(yǎng)體。這樣反復2—3次就可以完全殺死營養(yǎng)體和芽孢，也可保持某些營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞。

101整理課件⑤巴氏消毒法高溫對牛奶及其熱敏感物質(zhì)不適宜，因為高熱破壞了食品的營養(yǎng)與風味。低溫長時法：只要在63℃下維持30min高溫短時法：只要在72℃下維持15s超高溫法瞬時法:只要在135-150℃下維持2-6s102整理課件第八章微生物的遺傳與變異

103整理課件第一節(jié)遺傳的物質(zhì)根底一、三個證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實驗1、經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗肺炎鏈球菌:S型〔菌體具莢膜，菌落外表光滑，有致病能力〕R型〔菌體無莢膜，菌落外表粗糙，無致病能力〕104整理課件S型和R型細胞侵染試驗105整理課件實驗證明，將R菌轉(zhuǎn)化為S菌的轉(zhuǎn)化因子是DNA1944年，Avery精確重復了轉(zhuǎn)化實驗，確定了轉(zhuǎn)化因子106整理課件實驗證明，進入細菌細胞內(nèi)部的物質(zhì)是DNA。DNA包含有產(chǎn)生完整噬菌體的全部信息。2、噬菌體感染實驗107整理課件實驗證明，RNA可以傳遞遺傳信息。108整理課件〔三〕原核生物的質(zhì)粒凡游離于原核生物基因組以外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀的dsDNA分子，就是典型的質(zhì)粒。質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷毎话闶欠潜匦璧?；在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時能賦予宿主細胞以特殊的機能，從而使宿主得到生長優(yōu)勢。109整理課件〔一〕突變類型營養(yǎng)缺陷性的定義某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法在根本培養(yǎng)基上正常生長繁殖的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷性110整理課件〔三〕突變的特點

1.不對應性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應關系.〔變量試驗、涂布試驗、平板影印培養(yǎng)試驗〕

2.自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生.

3.稀有性：突變率低且穩(wěn)定。

4.獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響。

5.可誘發(fā)性：誘變劑可提高突變率。

6.穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。

7.可逆性：原始的野生基因到變異株的突變稱為正向突變，相反的過程那么稱為回復突變或回變。111整理課件2、誘變育種的原那么〔1〕使用簡便有效的誘變劑誘變劑物理因素化學因素紫外線激光離子束X射線r射線快中子烷化劑堿基類似物吖啶化合物112整理課件〔2〕選用優(yōu)良的出發(fā)菌株〔3〕處理單細胞或單孢子懸浮液〔4〕使用最正確誘變劑量劑量=強度〔濃度〕×作用時間相對劑量=殺菌率〔5〕利用協(xié)同效應〔6〕尋找和利用形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關指標〔7〕設計高效率篩選方案〔8〕根據(jù)具體情況創(chuàng)造新型篩選方案113整理課件3、突變株的篩選：〔1〕產(chǎn)量突變株的篩選〔2〕抗藥性突變株的篩選〔3〕營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選114整理課件突變株的篩選方法誘變檢出營養(yǎng)缺陷型淘汰野生型富集培養(yǎng)〔抗生素法〕〔菌絲過濾法〕夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法逐個檢出法影印平板法生長譜法115整理課件確定出發(fā)菌株↓菌種的純化選優(yōu)↓←出發(fā)菌株的性能鑒定同步培養(yǎng)↓制備單細胞〔或單孢子〕懸液↓←活菌濃度測定誘變劑的選擇與確定誘變劑量的預試驗↓誘變處理↓平板別離↓計形態(tài)變異的菌落數(shù)，計算突變率挑取疑似突變菌落純培養(yǎng)↓突變體的初步篩選↓←用簡單快捷的方法重復篩選↓←搖瓶發(fā)酵試驗選出突變體〔根據(jù)情況進行生產(chǎn)試驗或重復誘變處理〕誘變育種的一般步驟和方法116整理課件基因突變及其機制基因工程誘變自發(fā)突變點突變畸變堿基置換移碼突變轉(zhuǎn)換顛換缺失添加缺失添加異位倒立重復插入117整理課件1、誘發(fā)突變：物理、化學核生物的因素，提高突變率的人為的作法〔1〕堿基的置換118整理課件堿基對的置換可分成兩個亞類：一類是DNA鏈上的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換，稱為轉(zhuǎn)換；另一類是DNA鏈上的一個嘌呤被另一個嘧啶或是一個嘧啶被另一個嘌呤所置換，稱為顛換。

119整理課件移碼突變這是指由一種誘變劑而引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個堿基插入或缺失，從而使該部位后面全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄錯誤的一類突變。吖啶類染料及其化合物是移碼突變的有效誘變劑，例如三氨基吖啶，吖啶黃，吖啶橙，5-氨基吖啶。吖啶類化合物的誘變機制目前還不很清楚?，F(xiàn)普遍認為，由于吖啶類化合物是一種平面型三環(huán)分子結構，與一個嘌呤:嘧啶堿基對相似，因此能夠嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間，造成雙螺旋的局部解開，從而在DNA復制過程中，會使鏈上插入或缺失一個堿基，結果引起移碼突變。120整理課件紫外線對DNA的損傷及其修復嘧啶嘧啶二聚體UV121整理課件紫外線主要通過在同鏈DNA相鄰的嘧啶間或在互補雙鏈間形成以共價鍵結合的胸腺嘧啶二聚體，微生物能以多種方式去修復被紫外線損作后的DNA，主要方式有兩種：1、光復活作用。由于微生物中一般都存在著光復合作用，因此，用紫外線照射菌液時都須在紅光下進行操作處理微生物，而后在暗室或用黑布包起來培養(yǎng)。

嘧啶二聚體嘧啶光解酶122整理課件2、切除修復〔暗修復作用〕123整理課件一、原核生物的基因重組〔一〕轉(zhuǎn)化供體菌受體菌DNA片段受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段，通過交換組合把它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的局部遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。供體菌的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子。進行轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：124整理課件轉(zhuǎn)化過程：①從供體菌提取出轉(zhuǎn)化因子雙鏈DNA片段；②雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌的細胞外表特定位點結合；③在結合位點上，雙鏈DNA中的一條單鏈逐步降解，同時另一條鏈逐步進入受體細胞。④進入受體細胞的DNA單鏈與受體菌染色體組上同源區(qū)段配對，而受體菌染色體組的相應單鏈片段被切除，并被進入受體細胞的DNA單鏈所取代，于是形成了雜種DNA區(qū)段；⑤受體菌染色體進行復制，其中雜種區(qū)段被別離成兩個，一個恢復，一個形成一個轉(zhuǎn)化子。125整理課件轉(zhuǎn)化過程的特點：a〕對核酸酶敏感；b〕不需要活的DNA供體細胞；c〕轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的上下主要取決于轉(zhuǎn)化供體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關系；d〕通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多126整理課件〔二〕轉(zhuǎn)導

通過缺陷型噬菌體或溫和型噬菌體為媒介，將供體細菌細胞中DNA片段攜帶到受體細菌細胞中，從而使受體細菌獲得供體細菌的某些遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導。根據(jù)媒介噬菌體的不同，轉(zhuǎn)導分普遍性轉(zhuǎn)導和局限性轉(zhuǎn)導兩類。127整理課件1．普遍性轉(zhuǎn)導由缺陷型噬菌體誤包〔而非整合〕供體細菌DNA中的任何一局部片段〔包括核外遺傳物質(zhì)在內(nèi)〕后，當它再次感染受體細菌時，使后者獲得了這局部遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導。它的轉(zhuǎn)導頻率為105～108。2．局限性轉(zhuǎn)導由溫和噬菌體侵染而形成的某一溶源細菌群被誘導裂解時，其中極少數(shù)個體的DNA可能與噬菌體DNA發(fā)生假設干特定基因的交換，從而被整合到噬菌體的基因組上，當該噬菌體再次感染受體細菌時，就使受體細菌獲得了這一特定遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為局限性轉(zhuǎn)導，它的轉(zhuǎn)導頻率為10-6。128整理課件〔三〕接合通過供體細菌和受體細菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程，稱為接合〔有時也稱雜交〕。在細菌中，接合現(xiàn)象研究最清楚的是大腸桿菌。發(fā)現(xiàn)能夠進行接合現(xiàn)象的大腸桿菌有雄性與雌性之分，而決定它們性別的是由是否存在F因子所決定。129整理課件F因子又稱致育因子，是一種質(zhì)粒，分子量為5×107道爾頓；雌性細菌不含F(xiàn)因子，稱為F-菌株，雄性細菌含有游離存在的F因子，稱為F+菌株，當雄性細菌細胞中所含的F因子被整合在細胞核的DNA上，不呈游離狀態(tài)存在稱為Hfr菌株〔高頻重組菌株〕；有時被整合在細胞核DNA上的F因子，從DNA上面脫落下來，呈游離存在，但在脫落時，F(xiàn)因子有時能帶一小段細胞核DNA。我們將這種含有游離存在的但又帶有一小段細胞核DNA的F因子的細菌稱為F′菌株。130整理課件a〕F+細菌通過性毛與F-細菌接觸并發(fā)生相互作用；b〕F+細菌的F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F因子的一條鏈到F-細菌中。c〕F因子的一條鏈一進入F-細菌中，就在F-細菌中復制新的F因子。1〕F+×F-雜交d〕復制完成后，F(xiàn)-細菌變成F+，同時原有F+細胞也完成F因子另一條鏈的復制，所以轉(zhuǎn)移是F+的拷貝。所以最終雜交的結果是F-細菌變成F+細菌，而原有的F+細菌那么不變。131整理課件2〕Hfr×F-雜交Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移