鹽酸瑞芬太尼的化學(xué)成分鑒定

鹽酸瑞芬太尼的化學(xué)成分鑒定

鹽酸瑞芬泰尼（remembertima）的化學(xué)特征為4-（甲基苯基）-4-[（n-1-羥色胺）苯基]-1-羥色胺鹽酸鹽，結(jié)構(gòu)如圖1所示。鹽酸瑞芬太尼是一種新型的μ受體激動劑,其藥效強(qiáng),起效迅速,半衰期短,術(shù)中易于控制,術(shù)后患者蘇醒快,是臨床麻醉的理想藥物之一。目前,該品種僅收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn),但尚未被國內(nèi)外藥典收載,迄今也只有少量文獻(xiàn)報道。為了有效控制鹽酸瑞芬太尼的質(zhì)量,本文對其主要有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了更詳細(xì)研究和結(jié)構(gòu)鑒定。采用HPLC法分析鹽酸瑞芬太尼及其有關(guān)物質(zhì),對其可檢出的2個雜質(zhì)進(jìn)行分離純化,分別用制備高效液相法分離獲得雜質(zhì)Ⅰ,定向合成法獲得雜質(zhì)Ⅱ,并運(yùn)用LC-/MS、NMR、UV、IR等分析方法鑒定了結(jié)構(gòu),確定雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ分別為鹽酸瑞芬太尼的N-脫烷基化合物和去甲氧基化合物。本研究為鹽酸瑞芬太尼的質(zhì)量控制提供了重要的依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1色譜-質(zhì)譜條件LC-20AB型高效液相色譜儀,包括LC-20AB型泵,SPD-20A型紫外檢測器,SIL-20AC型自動進(jìn)樣器,LC-solution色譜工作站(日本島津)。PerkinElmerSpectrumOne紅外光譜儀,ShimadzuUV-160紫外分光光度計,Agilent6410B三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,BrukerAvance300MHZ核磁共振儀。1.2甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈等色譜圖件為分析純水、超純水的試劑鹽酸瑞芬太尼原料藥(由四川抗菌素工業(yè)研究所化學(xué)事業(yè)部提供,批號090901-090903,含量99.1%),甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。2初步推測與羥基黃酮酸有關(guān)的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)2.1鹽酸瑞芬尼雜質(zhì)的確認(rèn)2.1.1流動相-甲醇-乙腈體系應(yīng)用HPLC法檢查鹽酸瑞芬太尼中的有關(guān)物質(zhì),色譜條件如下:Kromasil-CN柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:0.03mol/L磷酸二氫鉀(磷酸調(diào)至pH3.0)-甲醇-乙腈(80:16:4);檢測波長:225nm;流速:0.8mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。從鹽酸瑞芬太尼的HPLC色譜圖(圖2A)中可以看出,在鹽酸瑞芬太尼主峰前存在2個雜質(zhì)小峰,按出峰順序,分別簡稱為雜質(zhì)Ⅰ(相對保留時間0.73)和雜質(zhì)Ⅱ(相對保留時間0.79)。2.2--m-6--3-菌株,3.通過LC/MS技術(shù)對鹽酸瑞芬太尼及相關(guān)雜質(zhì)的分子量進(jìn)行測定。色譜條件:色譜柱:KromasilCN(4.6mm×250mm,5μm),流動相:0.01mol/L甲酸銨緩沖溶液(pH6.0)-甲醇(60:40),檢測波長:225nm,流速:0.4mL/min,柱溫:30℃。質(zhì)譜條件:Agilent6104B三級四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;電噴霧ESI離子源;檢測模式:ESI(+);干燥氣:10L/min;電壓:120V。質(zhì)譜顯示:瑞芬太尼[M+H]+=377.2,雜質(zhì)Ⅰ[M+H]+=291.2,雜質(zhì)Ⅱ[M+H]+=363.3,由此得出各分子量為:M瑞芬太尼=376.2,M雜質(zhì)Ⅰ=290.2,M雜質(zhì)Ⅱ=362.3。根據(jù)LC/MS結(jié)果,結(jié)合鹽酸瑞芬太尼的結(jié)構(gòu)特點對2個雜質(zhì)進(jìn)行初步推測:(1)雜質(zhì)Ⅰ的分子量比瑞芬太尼少86,可能為鹽酸瑞芬太尼去丙酸甲酯降解產(chǎn)物。(2)雜質(zhì)Ⅱ的分子量比瑞芬太尼少14,可能為鹽酸瑞芬太尼18位上甲酯水解產(chǎn)物。3鹽酸瑞芬太尼及其相關(guān)雜質(zhì)的制備和結(jié)構(gòu)評價3.1雜質(zhì)的制備(1)雜質(zhì)Ⅰ的制備用制備高效液相法分離、制備雜質(zhì)Ⅰ。將鹽酸瑞芬太尼樣品適量置于坩堝內(nèi),放置185℃烤箱,變?yōu)槌赛S色時取出,用流動相稀釋成10mg/mL的溶液,取此溶液0.2mL,注入液相色譜儀。制備液相色譜條件為:色譜柱:Shim-packPREP-ODS(H)KIT,1.5×20cm;流動相:甲酸水(pH3.0)-乙腈(85:15);檢測波長:225nm;流速:8.0mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣體積:0.2mL;多次收集保留時間14.5~16.5min的組分溶液(如圖2B),合并收集溶液經(jīng)減壓蒸干即得雜質(zhì)Ⅰ。(2)雜質(zhì)Ⅱ的制備取鹽酸瑞芬太尼約5g,加入100mL的1mol/L的NaOH,放置20min,加入鹽酸中和。再加入90%乙醇50mL進(jìn)行攪拌,結(jié)晶,過濾,進(jìn)行真空干燥至恒重,得白色固體,即為雜質(zhì)Ⅱ。3.2鹽酸瑞芬太尼最重要的材料結(jié)構(gòu)試驗3.2.1碳化dept和13c-1hcosy將制備得到的雜質(zhì)Ⅰ作LC/MS分析,雜質(zhì)Ⅰ的分子離子峰[M+H]+為m/z291.2。進(jìn)一步對鹽酸瑞芬太尼與雜質(zhì)Ⅰ作NMR分析比較,并結(jié)合LC-MS的結(jié)果,推斷出雜質(zhì)Ⅰ的結(jié)構(gòu),雜質(zhì)Ⅰ為鹽酸瑞芬太尼N-脫烷基化合物,其結(jié)構(gòu)見圖1。雜質(zhì)Ⅰ的1H-NMR譜中,共有9組峰,22個氫。13C-NMR譜中,共有12組碳峰,有16個碳原子。結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)及分析:m/z291[M+H]+。1H-NMRδ:0.81(t,J=7.39Hz,3H,CH3),1.76(q,J=7.37Hz,2H,CH2),1.38(m,2H,CH2),2.0(m,2H,CH2),2.63(m,4H,CH2),3.64(s,3H,-OCH3),7.34(t,J=6.63Hz,2H,CH),7.45(m,1H,CH),7.50(m,2H,CH)。13C-NMRδ:9.12(q,C-9),28.35(t,C-8),34.05(t,C-11,C-14),42.13(t,C-12,C-13),51.61(q,C-16),62.59(s,C-10),128,54(d,C-3),129.27(d,C-2,C-4),130.51(d,C-1,C-5),139.16(s,C-6),172.49(s,C-7),173.31(s,C-15)。1H-1HCOSY譜顯示:δ0.81和δ1.76處2組共5個質(zhì)子的多重峰為相關(guān)峰,其為丙酰胺基上的甲基和次甲基的質(zhì)子峰;δ1.38、δ2.0、δ2.63處有3組各為2、2、4個質(zhì)子的多重峰為相關(guān)峰,其為哌啶環(huán)上4個次甲基的質(zhì)子峰;δ3.64處一組3個質(zhì)子的單峰為甲氧基上的質(zhì)子峰。δ7.34、δ7.45、δ7.50處有3組共5個質(zhì)子的多重峰為相關(guān)峰,其為苯環(huán)上的質(zhì)子峰。DEPT和13C-1HCOSY:在雜質(zhì)Ⅰ的13C-NMR譜中,共有12組碳峰,分子中有4組對稱的碳原子。從DEPT譜可知共有4組季碳峰、3組叔碳峰、3組仲碳峰和2組伯碳峰。在δC172.49、δC173.31處有兩組羰基的季碳峰,為結(jié)構(gòu)中1個酯羰基(C-15)和1個酰胺羰基(C-7);在δC51.61處有一組伯碳峰,在13C-1HCOSY譜中與δH3.64的質(zhì)子峰相關(guān),為羧基甲酯中甲氧基碳原子(C-16)的碳峰;在δC128,54、δC129.27、δC130.51、δC139.16處有1組季碳峰和3組叔碳峰,在13C-1HCOSY譜中分別與δH7.45、δH7.50、δH7.34的質(zhì)子峰相關(guān),為苯環(huán)上6個碳原子(C-3、C-2、C-4、C-1、C-5)的碳峰;在δC34.05、δC42.13、δC62.59處有1組季碳峰和2組仲碳峰,在13C-1HCOSY譜中分別與δH1.38、δH2.0、δH2.63的質(zhì)子峰相關(guān),為4位雙取代哌啶環(huán)上5個碳原子(C-11、C-14、C-12、C-13、C-10)的碳峰;在δC28.35、δC9.12處有1組仲碳峰1組伯碳峰,在13C-1HCOSY譜中分別與δH1.76、δH0.81的質(zhì)子峰相關(guān),為丙酰胺上次甲基(C-8)和甲基(C-9)的碳峰。3.2.2內(nèi)酰胺三s,4h,5,3.將制備得到的雜質(zhì)Ⅱ作LC/MS分析,雜質(zhì)Ⅱ的分子離子峰[M+H]+為m/z363.2。對雜質(zhì)Ⅱ作NMR、UV、IR分析,并結(jié)合LC-MS的結(jié)果,推斷出雜質(zhì)Ⅱ的結(jié)構(gòu)為鹽酸瑞芬太尼18位碳甲酯水解產(chǎn)物,雜質(zhì)Ⅱ的1H-NMR譜中,共有11組峰,26個氫。13C-NMR譜中,共有15組碳峰,有19個碳原子。其結(jié)構(gòu)見圖1。雜質(zhì)Ⅱ結(jié)構(gòu)確證:m/z:362.3[M+H]+。1H-NMRδppm:0.82(q,J=7.37Hz,3H,CH3),1.80(t,J=7.38Hz,2H,CH2),2.24~2.28(m,4H,CH2),2.49~2.51(m,4H,CH2),2.76(t,J=7.58Hz,2H,CH2),3.07~3.16(m,4H,CH2),3.14~3.16(m,2H,CH2),3.16~3.21(m,4H,CH2),11.10(s,1H,COOH),3.70(s,3H,-O-CH3),7.40(t,J=18.24Hz,2H,CH),7.33~7.36(m,1H,CH),7.49~7.51(m,2H,CH),12.68(s,-NHCl).13C-NMRδppm:9.10(q,C-9),28.27(t,C-16),28.51(t,C-8),29.97(t,C-11,C-14),48.77(t,C-12,C-13),50.92(t,C-15),52.70(q,C-19),59.82(s,C-10),129.06(d,C-3),129.60(d,C-2,C-4),130.42(d,C-1,C-5),138.26(s,C-6),171.37(s,C-17),173.31(s,C-18),173.31(s,C-7)。雜質(zhì)Ⅱ紫外吸收光譜的最大吸收波長206.4nm,與鹽酸瑞芬太尼的最大吸收波長206.8nm相比,沒有明顯差別。IR(KBr)cm-1:3010cm-1(VO-H),2978cm-1(VC-H),1596cm-1(VC=C)1493cm-1(VC=C),702cm-1(δC-H),1741cm-1(VC=O),1255cm-1(VC-O),1650cm-1(VC=O),1400cm-1(βO-H)。雜質(zhì)Ⅱ與鹽酸瑞芬太尼相比,結(jié)構(gòu)上的變化主要是酯水解并形成一個羧基,雜質(zhì)Ⅱ的13C-NMR圖譜上共有15個碳信號(兩對苯環(huán)上的芳基碳,兩對哌啶環(huán)上的次甲基碳為對稱結(jié)構(gòu)),DEPT譜顯示其中有3組-CH,5組-CH2,2組-CH3,5組-C的碳信號,比雜質(zhì)Ⅰ多兩組-CH2和一組-C;比鹽酸瑞芬太尼少一個,即18位碳水解掉的甲基。從1H-NMR上可以看出雜質(zhì)Ⅱ低場活潑氫信號為1個,為羧基上的氫。在雜質(zhì)Ⅰ結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,雜質(zhì)Ⅱ的1H-1HCOSY譜顯示:δ3.14~3.16和δ2.76處有2組共4個質(zhì)子的多重峰為相關(guān)峰,其為丙酸上2個次甲基的質(zhì)子峰;δ11.10處有1個質(zhì)子的單峰,為羧酸活潑氫的質(zhì)子峰。在δC50.92、δC28.27、δC171.37處有2組仲碳峰,1組季碳峰,在13C-1HCOSY譜中分別與δH2.76、δH3.14~3.16的質(zhì)子峰相關(guān),為丙酸上2個次甲基(C-15和C-16)和羰基(C-17)的碳峰。4討論4.1高溫和高溫條件下流動相分離試驗發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)Ⅰ隨溫度增加含量增高,為了獲取較高含量的雜質(zhì)Ⅰ樣品,降低分離難度,我們考察了鹽酸瑞芬太尼不同高溫破壞條件:分別為烘箱(150、160、170、180和185℃)加熱破壞;有機(jī)溶劑中加熱破壞;熔融破壞,結(jié)果表明在熔融(185℃)破壞條件下,雜質(zhì)Ⅰ的色譜含量最大,最適宜分離獲取。高溫破壞樣品產(chǎn)生雜質(zhì)Ⅰ的色譜分析見圖2C。制備液相條件參考2.1.1,發(fā)現(xiàn)流動相中加入甲醇,雜質(zhì)Ⅰ出峰較晚,不利于組分收集,因此考慮在流動相中不加甲醇,通過調(diào)整甲酸水與乙腈的比例,結(jié)果表明當(dāng)流動相比例:甲酸水:乙腈(85:15)時,雜質(zhì)Ⅰ出峰較快,且與主峰及其雜質(zhì)分離較好。還考察了流動相pH為6.0,5.0,4.0,3.0時的分離情況。結(jié)果表明當(dāng)pH為3.0時,峰形較好,且雜質(zhì)峰與主峰均基線分離。4.2堿破壞溫度的影響雜質(zhì)Ⅱ的增加與酸、堿、熱破壞因素有關(guān),堿破壞最為強(qiáng)烈,分別考察了堿濃度為0.5、1和2mol/LNaOH對雜質(zhì)Ⅱ含量的影響,結(jié)果表明鹽酸瑞芬太尼在強(qiáng)堿條件下,隨著堿濃度的增加及放置時間的延長,雜質(zhì)Ⅱ峰面積逐漸增加,1mol/L濃度以上堿破