一種魚類精巢顯帶的新方法

一種魚類精巢顯帶的新方法

在動物身上，魚的染色體非常小，而且數(shù)量很大，因此很難進(jìn)行研究。60年代特別是70年代中期以來,由于染色體制備方法學(xué)上的改進(jìn),使魚類染色體研究工作取得了長足進(jìn)展。迄今已對2000余種魚類進(jìn)行了染色體分析,但其中絕大多數(shù)偏重于常規(guī)的核型分析。運(yùn)用染色體多重帶技術(shù)(特別是高分辨帶技術(shù)),顯示出每條染色體縱向上的精細(xì)帶紋,可用于準(zhǔn)確的鑒別和區(qū)分各條染色體以及染色體片段,能對染色體的微小結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行精細(xì)分析,并能對原位雜交法的基因定位進(jìn)行詳細(xì)作圖,這些技術(shù)已在人類及哺乳類染色體研究中取得了巨大成功。然而,魚類染色體多重帶顯帶的技術(shù)卻落后甚遠(yuǎn)。從70年代中期開始,陸續(xù)有這方面的嘗試工作報道,許多學(xué)者試圖借鑒在哺乳類中已成功的G帶、Q帶、R帶、復(fù)制帶、高分辨帶、內(nèi)切酶帶等多重帶顯帶技術(shù),應(yīng)用于魚類體細(xì)胞染色體研究,雖然其中也有一些是較成功的探索,但就其帶紋數(shù)量、顯帶質(zhì)量以及顯帶方法的穩(wěn)定性而言,均未達(dá)到理想的效果。部分學(xué)者甚至斷言由于進(jìn)化地位較低,魚類染色體不能顯示出多重帶紋。然而也有部分學(xué)者認(rèn)為其原因在于方法學(xué)而非染色體本身。1993年,余其興等人鑒于魚類有絲分裂染色體分帶的研究現(xiàn)狀提出應(yīng)跳出傳統(tǒng)的思維模式,率先運(yùn)用全新的思路,以減數(shù)分裂粗線期二價體為研究對象,獲得了黃鱔的良好高分辨帶,而且其帶紋特征和數(shù)目是穩(wěn)定可靠的,并在魚類中首次對二價體進(jìn)行了區(qū)帶劃分和識別特征的描述,為魚類細(xì)胞遺傳學(xué)研究開創(chuàng)了一個全新的領(lǐng)域,對于魚類基因組精細(xì)結(jié)構(gòu)和基因定位的研究都具有重要的意義。然而黃鱔就其染色體數(shù)目而言是比較特殊的,其2n數(shù)僅為24,粗線期二價體數(shù)為12,因此在制備染色體標(biāo)本時相對比較容易。魚類中80%以上的種類其染色體數(shù)目都在40～60之間。因此余其興等人的方法是否適用于這些染色體數(shù)目較多的魚類呢?為此我們選擇染色體數(shù)目具有代表性的小型魚類——大鱗副泥鰍,對其二價體的制備和分帶進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1材料表面性成熟的雄性大鱗副泥鰍購自武漢市農(nóng)貿(mào)市場,采集時間為5～11月份。每條重約20～50g。1.2方法1.2.1精子的精巢化參照余其興等人的方法稍加改進(jìn)。取出發(fā)育成熟的精巢,迅速在0.85%NaCl中洗凈血污并剝除粘連的結(jié)締組織,然后以0.45%檸檬酸鈉∶0.075mol/L氯化鉀(1∶1v/v)混合液,室溫下低滲4～6小時,在此期間可見有許多精子從精巢中逸出,更換低滲液直至無明顯量的精子出現(xiàn)。再以卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定三次,每次20分鐘。將精巢剪碎,取上部細(xì)胞懸液以1000r/min離心10分鐘,重復(fù)兩次。常規(guī)空氣干燥法制片。1.2.2胰酶消化法嘗試的方法有三種,(1)EDTA法:取適度老化的標(biāo)本(室溫存放1個月以上或新片于50℃烤箱中處理24小時)于20mmol/LEDTA(pH8.0)中60℃30～50分鐘,蒸餾水沖洗后以1∶10Giemsa染色20分鐘;(2)常規(guī)胰酶消化法:經(jīng)0.075mol/LKCl低滲處理后的精巢組織直接用卡諾固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1v/v)固定兩次每次30分鐘;常規(guī)制片,經(jīng)烤片后胰酶消化,Giemsa染色;(3)堿性低滲液處理法:這是在嘗試各種低滲方法時偶然發(fā)現(xiàn)的,具體方法是,以5mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)0.45%檸檬酸鈉∶0.075mol/L氯化鉀(1∶1v/v)混合低滲液的pH值為7.2～7.4,室溫下低滲處理2～4小時,經(jīng)卡諾氏固定液整體固定兩次后,將精巢剪碎,取上部細(xì)胞懸液以1000r/min離心10分鐘,重復(fù)兩次,常規(guī)空氣干燥法制片,Giemsa染色。1.2.3價體g帶核型模式圖選擇分散良好,帶紋清楚的中粗線期的完整分裂相進(jìn)行顯微攝影、測量和排列分析,根據(jù)各個分裂相的測量結(jié)果,分別算出每條二價體的相對長度和標(biāo)準(zhǔn)誤,并根據(jù)10個細(xì)胞的二價體G帶帶紋特征比較,繪制大鱗副泥鰍二價體的G帶核型模式圖。2結(jié)果與討論2.1粗線期分帶特征經(jīng)EDTA顯帶法(圖版Ⅰ:1)、胰酶消化顯帶法(圖版Ⅰ:2)和堿性低滲法處理后(圖版Ⅰ:3,4),在大鱗副泥鰍粗線期二價體上發(fā)生了明顯的帶紋分化,顯示出十分豐富的多重帶型。帶紋清晰,反差明顯。在同時相不同分裂相中,帶型基本穩(wěn)定。粗線期二價體大致可以分為早中晚三個時期。每個時期取10個分散較好的分裂相,統(tǒng)計其相對長度、帶紋顯示情況。中粗線期分帶結(jié)果列于表1。帶紋總數(shù)為414條。粗線期二價體的帶紋可以分為強(qiáng)深染帶、深染帶和淺染帶三類。下面對幾條較特殊的二價體進(jìn)行描述。1號二價體在著絲粒區(qū)有一較寬的強(qiáng)深染帶,這是一個非常明顯的特征。即使在一些分帶較差的分裂相中也可以很容易識別出這一帶紋,并把該二價體與其它二價體區(qū)分開。6號二價體長臂的分帶比較特殊。在長臂上帶紋較多,但其上的深染帶與淺染帶區(qū)分不明顯,整條臂顯得著色很淺。而7號二價體正好相反,其上的深染帶都十分明顯,與淺染區(qū)的反差十分強(qiáng)烈。16號二價體為端部著絲粒,其臂上有很長的強(qiáng)深染帶,該帶占整條二價體的1/3左右。23號二價體上帶紋數(shù)目最少。在著絲粒部位有一較小的深染帶,緊接著是一很窄的淺染帶;所有余下的部分為一條帶,呈深染,其間看不出有帶紋分化。如此的帶紋特征是極少見的。2.2采用組合染色方法進(jìn)行二價體分帶分析以粗線期二價體為研究對象,進(jìn)行多重顯帶具有許多有利因素。比如該期的染色體螺旋化程度較低,可以從中選出長度適中的分裂相,無需經(jīng)過任何藥劑的誘導(dǎo)處理即可用于顯帶,而且由于同源染色體的緊密配對,二價體僅為體細(xì)胞染色體數(shù)目的一半;同時進(jìn)行減數(shù)分裂的細(xì)胞有天然的區(qū)域同步化趨勢,只要取材時期適宜,可以很容易地獲得大量的粗線期分裂相。但正是由于在粗線期時染色體較長,相互之間彼此纏繞,使得較難獲得分散良好的分裂相。因此如何提高二價體的分散程度成為進(jìn)行二價體分帶的關(guān)鍵。余其興等人應(yīng)用整體長低滲法在黃鱔中獲得了良好的結(jié)果。但是應(yīng)用同樣的方法在進(jìn)行大鱗副泥鰍二價體分帶時所獲結(jié)果并不理想,主要原因在于其染色體數(shù)目為48,比黃鱔多一倍,分散頗不易。為此,我們在余其興等人方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了多種探索,發(fā)現(xiàn)把低滲液pH值調(diào)高對二價體的分散有一定的作用,分散良好的分裂相約占總分裂相的10%,基本可以滿足帶型分析和基因定位的需要。用此種方法獲得的標(biāo)本經(jīng)普通Giemsa染色后,可以顯示出清晰的帶紋。用快速銀染法染色后帶紋清晰,NORs區(qū)域明顯(圖版Ⅰ:5,6)。這種方法可以直接獲得二價體的多重帶,簡單方便。所得帶紋與經(jīng)EDTA和胰酶法顯示的基本一致。在進(jìn)行二價體分析時的另一問題是如何把有絲分裂核型與減數(shù)分裂二價體核型對應(yīng)起來,我們采用的是相對長度對應(yīng)法。人類中的統(tǒng)計表明,相對長度的測量在二價體和有絲分裂染色體之間是非常一致的,因此只要進(jìn)行精細(xì)的相對長度的統(tǒng)計這個問題不難解決。另外,用C顯帶法確定著絲粒的位置也是解決這問題的辦法之一。有關(guān)人類和鼠的二價體研究業(yè)已證明,二價體上的染色粒結(jié)構(gòu)帶型是與有絲分裂高分辨帶帶型高度對應(yīng)的。粗線期二價體上的染色粒是其顯微水平的基本結(jié)構(gòu)特征,它的位置分布和堿基組成是與有絲分裂G帶中的深染帶紋基本吻合。相信以染色粒結(jié)構(gòu)為顯帶基礎(chǔ)的粗線期二價體染色體多重帶技術(shù),將會克服魚類有絲分裂染色體不利于進(jìn)行多重帶顯帶的客觀條件,為魚類、兩棲類動物以及植物的多重帶研究開辟一條新的更為簡捷的途徑。2.3結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)不同為什么堿性低滲液處理后就能顯示出清晰的帶紋呢?發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象以后,馬上用同樣的方法處理有絲分裂染色體,但沒有出現(xiàn)帶紋分化。一般認(rèn)為染色體本身在各個部位有一定的分化,各種顯帶法的作用使這一分化加強(qiáng)。根據(jù)這一基本思路,可以認(rèn)為減數(shù)分裂染色體上的染色?？赡苁沁@一顯帶法的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。染色粒是所有動植物減數(shù)分裂染色體上的共同結(jié)構(gòu)形式,一些堿性蛋白質(zhì)可能參與了其凝集過