血液中乙醇含量穩(wěn)定性影響因素分析

血液中乙醇含量穩(wěn)定性影響因素分析

在司法鑒定實(shí)踐中，乙醇濫用非常常見。測定乙醇含量是分析法醫(yī)中基本任務(wù)之一。血液中乙醇含量在保存過程中可能會(huì)因?yàn)檠趸?、揮發(fā)和微生物降解而減少,也可能因?yàn)檠焊瘮∽陨懋a(chǎn)生乙醇成分而升高。血醇樣本保存的穩(wěn)定性直接關(guān)系到檢測結(jié)果的評(píng)判。本文就影響乙醇結(jié)果穩(wěn)定性的四個(gè)因素即血液的保存溫度、儲(chǔ)存容器中空氣所占比例、乙醇質(zhì)量濃度和有無抗凝血?jiǎng)⒖寡趸瘎┓秩酵ㄟ^正交試驗(yàn)的方法進(jìn)行考察,以期確立影響血液中乙醇含量穩(wěn)定性的主要因素。1實(shí)驗(yàn)材料和方法1.1儀器吉爾森402稀釋儀、Agilent6890N型頂空氣相色譜儀(配氫火焰光度檢測器)。1.2乙醇對(duì)照品乙醇對(duì)照品(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院),乙醇系列濃度對(duì)照品(Restek公司),NaF(分析純),Na2O2(分析純)?？瞻兹?上海市血液中心)。1.3正交試驗(yàn)結(jié)果本課題對(duì)溫度、儲(chǔ)存容器中空氣所占比例、質(zhì)量濃度、防腐劑四個(gè)因素分三水平,通過四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)列表對(duì)血醇樣本分組。有關(guān)四因素三水平設(shè)定如表1所示。1.4樣品的制備1.4.1100mg乙醇儲(chǔ)存溶液精密稱取4.992g乙醇對(duì)照品于50mL容量瓶中,使用超純水定容至刻度,得99.84mg/mL乙醇儲(chǔ)備液。1.4.2乙醇質(zhì)量濃度的測定分別在500mL容量瓶中加入1、4和10mL乙醇儲(chǔ)備液,然后加全血定容至刻度,混勻。得乙醇質(zhì)量濃度分別為0.2、0.8和2.0mg/mL的血液樣本。每個(gè)濃度的血液樣本按照正交試驗(yàn)列表要求分別加入1%NaF和Na2O2。1.4.3溫度分布檢按照正交試驗(yàn)列表,九組待測樣本按照溫度(20、4、-20℃)分為三組分別放置于室溫(20±3)℃、冷藏柜(4℃)和冷凍柜(-20℃)中待檢。1.5測量不確定度從三個(gè)濃度的樣本中分別抽取18個(gè)樣本進(jìn)行檢測,以測試樣本的平均值±測量不確定度作為待測樣本的初始質(zhì)量濃度。測量不確定度定為5%,初始質(zhì)量濃度分別為(0.234±0.01)mg/mL、(0.766±0.04)mg/mL和(2.032±0.10)mg/mL。1.6樣本測定結(jié)果為了確保實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的任何離群結(jié)果不能歸咎于樣品之間的變異性,我們以0.8mg/mL樣本為例對(duì)樣本進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)過程和方法如下:(1)從0.8mg/mL樣本總體中抽取10個(gè)樣品用于均勻性檢驗(yàn);(2)對(duì)抽取的每個(gè)樣品,在重復(fù)條件下測試兩次;(3)均勻性檢驗(yàn)中所使用的乙醇含量測定方法與穩(wěn)定性考察中乙醇含量測定所使用的方法一致;(4)采用單因子方差分析法對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,檢驗(yàn)及分析結(jié)果如表2和表3。F0.05(9,10)=3.02。本例中F=1.19<F0.05(9,10),說明血液樣本之間無顯著性差異即血液樣品中的乙醇濃度是均勻的。1.7測試實(shí)驗(yàn)1.7.1空氣相圖的測定參照卓先義等血液中乙醇檢測方法對(duì)血液樣本進(jìn)行檢測。1.7.2對(duì)照品溶液、內(nèi)標(biāo)及測定使用吉爾森402稀釋分配儀分別取100μL0.15、0.8、1.0、2.0、3.0mg/mL系列濃度對(duì)照品,同時(shí)加500μL叔丁醇(40μg/mL)作為內(nèi)標(biāo)于10mL頂空瓶中,加硅膠墊鋁蓋密閉。每個(gè)濃度平行測定2份。在每次測定樣品的同時(shí),繪制工作曲線,要求工作曲線的相關(guān)系數(shù)γ>0.999。1.7.3乙醇含量測定對(duì)正交試驗(yàn)列表分列的九組實(shí)驗(yàn)樣本每隔15天抽取其中一小組進(jìn)行一次測定,樣本配制同工作曲線配制過程。2結(jié)果和討論2.1行道2.2測定結(jié)果及統(tǒng)計(jì)見表4。初始濃度值加和=1.404+4.596+12.192=18.192。Z1、Z2、Z3值與初始濃度加和進(jìn)行比較,可知B、C、D三因素最佳組合是B2C2D1即4℃、儲(chǔ)存容器中空氣所占比例為50%以及添加防腐劑(NaF)的情況下保存血液樣本穩(wěn)定性結(jié)果最佳。2.2變量方差分析(1)組間變異:組間自由度:f組=9-1=8組間均方J組=S組2×K/N=1.8592×9/54=0.576B因素:均方J=2.534×3/54=0.3576次測定平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差S次=0.715次間自由度:f次=6-1=5次間均方:J次=0.715×6/54=0.057(3)誤差54次測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差S總=0.776總自由度:f總=54-1=53誤差均方:J=[S總2×f總-(f次×J次+f組×J組)]/fe=[0.776×53-(5×0.057+8×0.576)]/40=0.336各因素方差分析見表5。方差分析顯示B因素F值>1,存在顯著性差異,這表明在體積、溫度和防腐劑三個(gè)因素中,溫度為影響血液中乙醇含量穩(wěn)定性的主要因素。2.3血液質(zhì)量濃度與自身質(zhì)量濃度的關(guān)系濃度對(duì)穩(wěn)定性的影響我們選取同一溫度下三個(gè)不同血醇濃度組第一次測定與第六次測定值變化進(jìn)行討論。測定結(jié)果見表6。從表6中可以看出,不同質(zhì)量濃度血液樣本在適當(dāng)溫度條件下保存三個(gè)月后血醇質(zhì)量濃度變化百分?jǐn)?shù)基本一致,即血醇質(zhì)量濃度變化與自身質(zhì)量濃度大小無明顯關(guān)系。同時(shí),在20℃條件下保存血液樣本,由于血液有一定程度的腐敗,導(dǎo)致血醇質(zhì)量濃度明顯升高,但加防腐劑后對(duì)腐敗有一定的抑制作用,結(jié)合保存過程中血醇質(zhì)量濃度測定結(jié)果可以看出,在20℃加防腐劑情況下保存,在第一個(gè)月段血醇質(zhì)量濃度無顯著性變化。2.4牛血中乙醇質(zhì)量濃度檢測本實(shí)驗(yàn)初曾嘗試采用牛血代替人血進(jìn)行實(shí)驗(yàn),使用牛血配置樣本后,室溫放置三天后牛血樣本中乙醇質(zhì)量濃度可降至0,然而同樣條件采用人血進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)保存10天中未見乙醇質(zhì)量濃度發(fā)生明顯變化,我們推測牛血樣本存在特異性的酶可對(duì)乙醇產(chǎn)生氧化反應(yīng),要確證此種假設(shè)還有待進(jìn)一步的研究。3血液樣本c溫度、儲(chǔ)存容器中空氣所占比例、質(zhì)量濃度、防腐劑四個(gè)因素中溫度對(duì)血液質(zhì)量濃度保存穩(wěn)定性影響最大,其中4℃情況下保存血液樣本,