碘硝基四唑紫法檢測發(fā)酵制氫系統(tǒng)產(chǎn)氫效能的指標(biāo)優(yōu)化

碘硝基四唑紫法檢測發(fā)酵制氫系統(tǒng)產(chǎn)氫效能的指標(biāo)優(yōu)化

0污水處理酶活性測定指標(biāo)對于以厭氧化廢水為基礎(chǔ)的有機(jī)廢水發(fā)芽法生物制氫系統(tǒng)，目前主要采用混合溶液中的蒸發(fā)懸浮固體（mlss，mlss）與總懸浮固體（mlss）之間的比率（mlpss/mlss）、生物污染（mlpss）的比（l/（gd）、cod去除率（%）和其他參數(shù)來表征發(fā)酵產(chǎn)生的氫污泥的活性。由于MLVSS中不僅包含了活性微生物細(xì)胞,同時(shí)也包含了無活性的,甚至是死亡的微生物殘?bào)w及吸附的非揮發(fā)性有機(jī)物,以MLVSS/MLSS為指標(biāo)將會高估污泥的生物活性,而以比產(chǎn)氣(氫)速率為標(biāo)準(zhǔn)則會低估污泥的生物活性。在發(fā)酵生物制氫系統(tǒng)中,由于高分子有機(jī)物在發(fā)酵微生物菌群作用下轉(zhuǎn)化成了低分子的有機(jī)揮發(fā)酸(VFAs)及醇類(同時(shí)釋放H2和CO2),即便是在底物轉(zhuǎn)化率較高的情況下,其COD去除率也是十分有限的,且會因發(fā)酵末端產(chǎn)物的變化而表現(xiàn)出很大的波動性,有時(shí)甚至出現(xiàn)負(fù)去除率的情況。因而,以COD去除率作為系統(tǒng)微生物活性的衡量指標(biāo)也不夠科學(xué)。脫氫酶是微生物活性細(xì)胞分泌的一種有機(jī)大分子,其存在水平可以客觀反映廢水生物處理系統(tǒng)中活性污泥的生物活性。目前,脫氫酶活性(DHA)測定的常用方法有氯化三苯基四氮唑(TTC)法和碘硝基四氮唑紫(iodonitrotetrazoliumchloride,INT)法。TTC的氧化還原電位(ORP)為+490mV,而INT的ORP為+90mV,因此INT對電子的親和力要大于TTC。在厭氧生物處理系統(tǒng)中,底物的降解轉(zhuǎn)化是在較低的ORP環(huán)境中進(jìn)行,此時(shí)用INT作為電子受體來檢測DHA,其效果可能更為顯著。盡管采用INT法檢測DHA并用于表征廢水處理系統(tǒng)中污泥活性的研究已有報(bào)道,由于影響INT法檢測效果的因素較多,欲以其作為表征產(chǎn)酸發(fā)酵系統(tǒng)污泥活性的指標(biāo),必須進(jìn)行針對性的修正和優(yōu)化。本研究以有機(jī)廢水發(fā)酵法生物制氫系統(tǒng)的絮狀厭氧活性污泥為對象,對影響DHA檢測的INT濃度、pH值、萃取劑、終止劑、反應(yīng)時(shí)間和溫度等因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)與分析,以確定最佳檢測條件,明晰與厭氧活性污泥比產(chǎn)氫速率的相關(guān)性,以期為發(fā)酵生物制氫系統(tǒng)微生物活性的客觀及時(shí)監(jiān)測提供科學(xué)方法,指導(dǎo)反應(yīng)器的啟動和運(yùn)行。1材料和方法1.1樣品的配制和分析方法活性污泥樣品取自本實(shí)驗(yàn)室的厭氧折流板反應(yīng)器(ABR)生物制氫系統(tǒng),呈絮狀,采集過程采用氮?dú)獗Ｗo(hù)。無水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、甲苯、乙醚、丙酮和終止劑甲醛、乙醇、三氯乙酸、98%濃硫酸等萃取劑,均為分析純化學(xué)試劑;由美國Searchbio公司提供的INT標(biāo)準(zhǔn)樣品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%),制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%(1.98mol/L)的儲備液備用;緩沖液鄰苯二甲酸氫鉀溶液(pH4)、乙酸鈉溶液(pH5)、磷酸二氫鉀與磷酸氫二鈉混合液(pH6、7)、Tris-HCl緩沖液(pH8、8.5)和四硼酸鈉溶液(pH9),根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行配置。萃取液吸光度使用752型紫外光柵分光光度計(jì)(山東高密彩虹分析儀器有限公司)測定,選用光程1cm、高度5cm的玻璃比色皿。其他主要設(shè)備包括:THZ-82型水浴振蕩器(金壇市億通電子有限公司)、FAN2004型電子天平(Hangping)、SPX1508型生化培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)和TGL-16G-B臺式離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)等。1.2碘苯基四氮唑int--3-甲基苯甲織物.7.4的合成pH值、MLVSS等常規(guī)分析項(xiàng)目,均采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定。在探討各種因素對DHA檢測的影響時(shí),采用單因素多水平實(shí)驗(yàn)法,即在基礎(chǔ)操作條件下,只改變所考查因素的水平,其他因素及其水平不變?；A(chǔ)操作方法為:向10mL的離心管中依次加入0.3mL的污泥樣品(每升含2.7gMLVSS)、1.5mL的Tris-HCl緩沖溶液(pH8.4)和1mL的0.1%INT溶液,迅速放在37℃的水浴振蕩器內(nèi),暗處振蕩反應(yīng)30min,然后加入1mL的37%甲醛以終止酶反應(yīng);將終止反應(yīng)后的樣品在5000r/min下離心5min,棄上清液,加入5mL丙酮,混合攪拌均勻,在37℃下暗處振蕩10min以萃取反應(yīng)產(chǎn)物碘硝基四氮唑甲簪(INF,紅色);在5000r/min下再離心5min,并在485nm處測定萃取液吸光度。比脫氫酶活性通過下式計(jì)算:式中,UI為污泥樣品的INT-比脫氫酶活性(μmol/(g·min)),A為最適波長處的萃取液吸光度,V為萃取劑體積(mL),K為INT-A標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,W為污泥樣品MLVSS干重(mg),為暗培養(yǎng)時(shí)間(min)。INT-A標(biāo)準(zhǔn)曲線將在確定最優(yōu)條件后制作,并由其求得系數(shù)K。2結(jié)果與討論2.1卓測條件優(yōu)化2.1.1酶促反應(yīng)產(chǎn)物萃取液ph的測定在基礎(chǔ)操作的基礎(chǔ)上,在波長420~500nm范圍內(nèi)考查了分光光度計(jì)發(fā)射波長對酶促反應(yīng)產(chǎn)物萃取液吸光度的影響。結(jié)果表明,在波長為438nm處,INF萃取液(丙酮)具有最大A值,為0.64。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用這一波長檢測INF萃取液的吸光度。2.1.2酶反應(yīng)時(shí)間及溫度在基礎(chǔ)操作條件下,首先對影響INT-比脫氫酶活性測定的INT濃度、暗反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和不同緩沖劑等進(jìn)行了試驗(yàn)(表1)。結(jié)果表明,①在INT溶液的濃度從0.01%(19.8mmol/L)逐漸增加到0.1%(198mmol/L)時(shí),萃取液的A值從0.18大幅提高到0.51;當(dāng)INT濃度繼續(xù)逐步增加到0.8%時(shí),A的增加值只有0.17,增加趨勢不再顯著。②當(dāng)酶反應(yīng)時(shí)間從10min增加到30min時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物萃取液A值從0.14提升到了0.25,反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加時(shí),A值的增加不再明顯。③根據(jù)目前報(bào)道的發(fā)酵生物制氫研究常采用的發(fā)酵溫度范圍,在進(jìn)行DHA測定中,當(dāng)溫度從25℃逐步提高到45℃時(shí),所測反應(yīng)產(chǎn)物萃取液A值從0.20增加到了0.37(表1);溫度繼續(xù)升高時(shí),A值則表現(xiàn)出下降趨勢。④在不改變緩沖液加入量(1.5mL)的前提下,采用pH5的乙酸鈉溶液作為緩沖劑時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物萃取液的A值最大,為0.58;而在其他緩沖劑條件下,測得的A值均偏低,處于低于0.28的水平。以上試驗(yàn)結(jié)果表明,INT-比脫氫酶活性測定的INT濃度、酶反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及緩沖劑分別選擇198mmol/L、30min、45℃和pH5的乙酸鈉溶液比較適宜。2.1.3n條件下各種終止劑的體外藥物萃取為精確計(jì)算DHA,應(yīng)合理選擇酶反應(yīng)終止劑,以保證酶反應(yīng)在設(shè)定時(shí)間及時(shí)終止。在確定反應(yīng)時(shí)間為30min的條件下,三氯乙酸、甲醛、乙醇和濃硫酸等4種終止劑的試驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明,這4種終止劑都可以有效地終止酶反應(yīng),在終止反應(yīng)后的5min和10min,萃取液的A值均無顯著變化。但從INF萃取液的A值大小分析,濃硫酸則顯著優(yōu)于其他3種終止劑,其A值可達(dá)0.42以上,而其他3種終止劑的A值則在0.28以下。2.1.4萃取劑的選擇為提高酶促反應(yīng)產(chǎn)物INF萃取效果,在基礎(chǔ)操作的基礎(chǔ)上,分別考查無水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、甲苯、乙醚和丙酮等7種萃取劑的萃取效果(圖2)。結(jié)果表明,以乙醇為萃取劑時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物萃取液A值最高,為0.53,顯著高于其他幾種萃取劑的A值。以乙醇作為萃取劑,有對人體無害的優(yōu)點(diǎn)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)單因素多水平試驗(yàn)得到的INT-比脫氫酶活性測定優(yōu)化操作條件,即可制作INT-A標(biāo)準(zhǔn)曲線:取適量1%的INT儲備液,用pH5的乙酸鹽緩沖液將其稀釋成摩爾濃度分別為98,198,395,790,1581mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的抗壞血酸0.2mL,振蕩搖勻,45℃下暗處振蕩反應(yīng)30min,然后加入1mL的濃硫酸終止酶反應(yīng);反應(yīng)混合液在5000r/min下離心5min,棄去上清液,加入5mL無水乙醇,45℃下暗處振蕩萃取10min,5000r/min離心5min,438nm處測定上清液A值,由此得到INT-A標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3),其方程為式中,x為萃取液中的INF濃度(μmol/L),y為相應(yīng)的A值。x與y具有很好的相關(guān)性,判定系數(shù)R2達(dá)0.9952。由式(2)得到斜率常數(shù)K=0.0111,帶入式(1)即得到比脫氫酶活性UI計(jì)算公式:2.3mlvss脫氫酶活性的測定從ABR制氫反應(yīng)系統(tǒng)不同部位,采集不同濃度的厭氧活性污泥(絮狀)樣品。向10mL的離心管中依次加入0.3mL的污泥樣品(MLVSS:2.66~26.64g/L)、1.5mL的乙酸鹽緩沖溶液(pH5)、1mL的0.1%INT溶液;在45℃的水浴振蕩器內(nèi)暗處振蕩反應(yīng)30min,然后加1mL的濃硫酸終止酶反應(yīng);在5000r/min下離心5min,棄去上清液,加入5mL無水乙醇,混合攪拌均勻,在45℃下暗處振蕩10min,萃取反應(yīng)產(chǎn)物INF;在5000r/min下再離心5min,并在分光光度計(jì)的438nm處讀取A值。以污泥樣品的濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)A值為縱坐標(biāo)作圖,即得到污泥濃度-A值曲線(圖4)。結(jié)果表明,MLVSS在2.66~26.64g/L的范圍內(nèi),與A值呈現(xiàn)很好的正相關(guān)性,R2達(dá)到了0.9939,說明INT法均能有效檢測脫氫酶活性。為減少誤差,A值處于0.2~0.7的范圍比較理想,根據(jù)圖4給出的線性回歸方程計(jì)算,相應(yīng)的MLVSS應(yīng)在3.5~12.5g/L范圍。實(shí)際檢測中,污泥樣品的MLVSS建議采用9g/L。2.4數(shù)據(jù)處理和分析在ABR進(jìn)入HRT30h、進(jìn)水COD8000mg/L的運(yùn)行階段,對前兩個(gè)格室中活性污泥的比產(chǎn)氫速率和INT-比脫氫酶活性進(jìn)行連續(xù)檢測和分析,結(jié)果如表2所示(第1次取樣計(jì)為第1天)。采用MicrosoftExcel中的Correl函數(shù)分別對兩個(gè)格室活性污泥的比產(chǎn)氫速率和INT-比脫氫酶活性兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,其相關(guān)系數(shù)分別為0.92和0.94,均大于0.8,說明活性污泥的INT-比脫氫酶活性與比產(chǎn)氫速率非常高度相關(guān)?？梢?INT-比脫氫酶活性這一參數(shù),可以客觀準(zhǔn)確地反映厭氧生物制氫系統(tǒng)污泥的產(chǎn)氫活性。3含氟低硫酸鈉緩沖劑提取細(xì)胞系數(shù)和用量1)通過單因素多水平實(shí)驗(yàn),確定了產(chǎn)酸發(fā)酵生物制氫系統(tǒng)厭氧活性污泥INT-比脫氫酶活性檢測的適宜條件,即10mL離心管中,先后加入0.3mL的污泥樣品、1mL198mmol/L的INT