淋巴細(xì)胞亞群測定

淋巴細(xì)胞亞群測定辦法流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理：雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的多個單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上對應(yīng)的抗原結(jié)合，通過溶血、洗滌（和固定）等環(huán)節(jié)后，在流式細(xì)胞儀上進行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對計數(shù)。淋巴細(xì)胞表面抗原分布以下：T淋巴細(xì)胞：CD3+；B淋巴細(xì)胞：CD3-，CDl9+；輔助性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+；克制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+；NK細(xì)胞：CD3-CDl6+56+等。根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上CD分子體現(xiàn)的不同，流式細(xì)胞儀能夠分辨出淋巴細(xì)胞及其多個不同的亞群，運用計算機軟件計算出淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count組會自動得出絕對計數(shù)。標(biāo)本采集與解決受檢者的準(zhǔn)備檢核對象生活飲食處在日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血規(guī)定1．樣本量1ml。2．樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)解決，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3．樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L，樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個核細(xì)胞。試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫爾特成分1：單克隆抗體液體2—8℃(CD45/4/8/3No.6607013CD45/56/19/3No.6607073CD4/8/3No.IM1650同型對照IgG1/IgG1/IgG1No.IM1672CD3/19No.IM1293CD3/16+56No.IM2076CD19-PC5No.IM2643Flow-Count熒光微球No.7547053)2：全血溶血試劑(Q-Prep)液體(No.7546946)A：甲酸液體70ML室溫B：碳酸鈉等液體32ML室溫C：多聚甲醛液體14ML室溫(OptilyseCNo.IM1401)液體室溫3：鞘液(No.8546859)液體20L室溫4：清洗液(No.8546930)液體5L室溫5：熒光微球(No.6605359)液體10ML2-8℃(Flow-Check)儀器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra樣本制備：1)按照規(guī)定，分別向已編好號的試管中加入10/20ul單克隆抗體和同型對照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a.OptiLyseC(按闡明書環(huán)節(jié)溶血)b.使用COULTERQ—PREP制備系統(tǒng)開機---顯示READY燈亮---選擇35SEC燈亮---開門---放入試管關(guān)門---自動進行溶血---顯示READY燈亮---開門---取出試管---再進行下一種樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)上機測樣（可根據(jù)樣本狀況選擇洗或不洗上樣）6)需要做絕對計數(shù)的指標(biāo)，在對應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Count(務(wù)必做到三同：同槍，同人，同種辦法加Flow-Count，并且加完即上機)報告成果報告百分?jǐn)?shù)（和絕對值）操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2％參考值(百分?jǐn)?shù)（絕對值）)CD3+60.8-75.4%(1141-1880)CD4+29.4-45.8%(478-1072)CD8+18.2-32.8%(393-742)NK9.5-23.5%(175-567)Th/Ts1.05-2.031.T、B淋巴細(xì)胞亞群是重要的免疫狀態(tài)檢測指標(biāo)，在腫瘤、免疫缺點、病毒感染，本身免疫性疾病、創(chuàng)傷、急性感染