基于生物活性的蒼術(shù)自毒作用生物學(xué)研究

基于生物活性的蒼術(shù)自毒作用生物學(xué)研究

蒼術(shù)是一種常見(jiàn)的中藥，其醫(yī)學(xué)部位是科日科日科天竺葵（thunb）c。主要功效為燥濕健脾,祛風(fēng)散寒,明目。野生蒼術(shù)在我國(guó)境內(nèi)分布廣泛,但近年來(lái)由于過(guò)度采挖及生境被嚴(yán)重破壞,造成資源緊缺。尤其是江蘇茅山地區(qū)的蒼術(shù),作為蒼術(shù)道地藥材,近年來(lái)已無(wú)法形成商品收購(gòu)。為緩解蒼術(shù)資源緊張態(tài)勢(shì),尤其是為了保護(hù)蒼術(shù)道地藥材,不少地方紛紛開(kāi)始對(duì)蒼術(shù)進(jìn)行引種栽培。但蒼術(shù)栽培種植中病蟲(chóng)害嚴(yán)重,并隨栽培年限增加,其發(fā)病率和死亡率均升高,同時(shí),生產(chǎn)中存在明顯的連作障礙,這些都嚴(yán)重地影響了蒼術(shù)的栽培種植。引起植物連作障礙的原因主要有土壤養(yǎng)分失衡、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變、植物毒素物質(zhì)增加及土壤物理化學(xué)性質(zhì)改變等。植物在環(huán)境脅迫下,往往通過(guò)向環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制種內(nèi)外其它植物的生長(zhǎng)以提高其自身的生存競(jìng)爭(zhēng)力,這種現(xiàn)象被稱(chēng)為化感作用(Allelopathy)。自毒現(xiàn)象(autotoxicity)是化感作用的重要形式之一,它是指植物根分泌和殘茬降解所釋放出的次生代謝物,對(duì)自身或種內(nèi)其它植物產(chǎn)生危害的一種現(xiàn)象,它是植物適應(yīng)種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果,許多作物的連作障礙與此相關(guān)。因此,研究自毒作用對(duì)揭示植物連作障礙具有重要意義?；形镔|(zhì)的提取分離和鑒定及其生物活性的檢測(cè)是研究植物化感作用或自毒現(xiàn)象的基礎(chǔ),通常以待測(cè)樣品的植物部分,或者是與它相關(guān)的環(huán)境土壤作為提取源進(jìn)行提取分離[8,9,11,12,13,14,8,9,10,11,12,13,14]。為了證實(shí)蒼術(shù)的自毒作用,本研究取未種植過(guò)其他植物的土壤對(duì)蒼術(shù)進(jìn)行栽培,8個(gè)月后進(jìn)行自毒作用分析。參考了劉秀芬和閻飛的方法,首先研究了蒼術(shù)根莖及根際土提取液對(duì)蒼術(shù)種子發(fā)芽及生長(zhǎng)的影響。然后,采用GC-MS分析鑒定了蒼術(shù)根莖和根際土水提液所含的化合物,并對(duì)其中可能的化感物質(zhì)進(jìn)行了生物學(xué)檢測(cè),從而為證明自毒作用是蒼術(shù)連作障礙的原因之一提供了理論依據(jù)。1材料和方法1.1不同濃度和土壤對(duì)惡種菌種的覆蓋,利用傳統(tǒng)植物收集根際土2004年12月21日開(kāi)始對(duì)蒼術(shù)進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)地點(diǎn)為中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境中心土壤室溫室。土壤取自中國(guó)中醫(yī)研究院附近拆遷舊房院內(nèi)土,該土此前未種植過(guò)任何植物。將土壤進(jìn)行翻曬后,按土壤與河沙3∶1混勻,加有機(jī)氮肥及KH2PO3適量。實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)重復(fù),每盆播種蒼術(shù)種子7粒,出苗后定苗3株,常規(guī)管理。2005年8月24日,采收蒼術(shù)根莖,風(fēng)干,粉碎研細(xì),過(guò)40目篩,混勻備用,編號(hào)A。并采用抖落法收集蒼術(shù)根際土,40目篩篩去根際土中殘留的蒼術(shù)須根等,混勻備用,編號(hào)S。栽培實(shí)驗(yàn)與化感作用生物活性檢測(cè)所用蒼術(shù)種子,為同一批樣品,均來(lái)源于江蘇茅山。1.2方法1.2.1酶活劑水取蒼術(shù)根莖40g,加蒸餾水適量,25℃浸泡24h,減壓抽濾,定容至200ml,得到相當(dāng)于蒼術(shù)根莖200mg/ml的上清液,編號(hào)A200。將A200分別稀釋4倍和20倍,得到相當(dāng)于蒼術(shù)根莖50,10mg/ml溶液,編號(hào)A50和A10。取蒼術(shù)根際土200g,加蒸餾水適量,25℃浸泡24h,減壓抽濾,定容至400mL,得到相當(dāng)于蒼術(shù)根際土500mg/ml上清液,編號(hào)S500。將S500分別稀釋2.5倍和10倍,得到相當(dāng)于蒼術(shù)根際土200、50mg/ml的溶液,編號(hào)S200和S50。用作蒼術(shù)化感作用的生物學(xué)的研究。設(shè)水(編號(hào)CK),A10、A50、A200、S50、S200及S500共7個(gè)處理,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)選取20粒種子,0.1%HgCl消毒10min,隨機(jī)鋪在墊有濾紙的直徑為15cm的培養(yǎng)皿中,分別加入水、不同濃度根莖或根際土水提液各5ml,在25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。不斷觀(guān)察,第5天測(cè)量發(fā)芽率、第7天測(cè)量胚根長(zhǎng),第14天測(cè)量胚芽長(zhǎng)。1.2.2乙醇及乙酸乙酯萃取液取蒼術(shù)根莖及根際土樣品適量,蒸餾水浸泡24h,其間多次震搖。離心使蒼術(shù)根莖及土壤沉淀,上清液抽濾。濾液加入等量乙醚萃取得到乙醚萃取液,剩余水提液再用等量乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯萃取液。所得乙醚及乙酸乙酯萃取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在4℃濃縮至干,再分別用乙醚或乙酸乙酯1ml溶解,用于GC-MS分析。乙醚及乙酸乙酯均為分析純。氣質(zhì)聯(lián)用儀器為T(mén)RACEGC2000,DB-5MS石英毛細(xì)管柱0.25mmID×30m×0.25μm,進(jìn)樣溫度250℃,程序升溫從60℃到290℃,15℃min-1,載氣為He。EI源,70ev,接口溫度250℃,源溫200℃,檢測(cè)溫度200℃,進(jìn)樣量1μl,35～650全掃描。應(yīng)用MAINLIB質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算機(jī)檢索系統(tǒng)分析質(zhì)譜圖,進(jìn)行未知物的鑒定。1.2.3自毒作用的生物學(xué)鑒定選取蒼術(shù)根莖中含量較大的倍半萜類(lèi)成分β-桉葉醇,進(jìn)行自毒作用的生物學(xué)鑒定。以苯甲醛為陽(yáng)性對(duì)照。二者均設(shè)50、100、250mg/L3個(gè)水平。1.2.4根際土中化合物的相似度通過(guò)SPSS10.0軟件,利用單因子方差分析結(jié)合多重比較分析種子發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)及胚芽長(zhǎng)的差異。借鑒Jaccard相似系數(shù)公式,比較根莖與根際土中化合物的相似度,J=c/(a+b+c)%,a為根莖中特有組分?jǐn)?shù)目,b為根際土中特有組分?jǐn)?shù)目,c為根莖與根際土中共有組分的數(shù)目(a,b所代表組分歸一化百分含量大于1%,c所代表兩個(gè)共有組分中至少有一個(gè)的歸一化百分含量大于≥1%)。2結(jié)果2.1土提取液濃度對(duì)溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響在實(shí)驗(yàn)中,50mg/ml及200mg/ml根際土提取液對(duì)蒼術(shù)種子發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)及胚芽長(zhǎng)均無(wú)影響。500mg/ml根際土提取液對(duì)蒼術(shù)種子發(fā)芽率無(wú)影響,稍抑制了蒼術(shù)胚根與胚芽的伸長(zhǎng),但差異不顯著(p>0.05,圖1)。單因子方差分析結(jié)合多重比較分析表明,隨蒼術(shù)根莖提取液濃度的增大,其對(duì)蒼術(shù)種子發(fā)芽率、胚根和胚芽伸長(zhǎng)的抑制作用顯著增大。經(jīng)200mg/ml蒼術(shù)根莖提取液處理的蒼術(shù)種子發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)及胚芽長(zhǎng)分別為對(duì)照的13%、32%及24%(p<0.05,圖1,表1)。2.2莖及根際土中各組分含量的相似系數(shù)利用GC-MS分析,從蒼術(shù)根莖中共鑒定出20個(gè)化合物,根際土共鑒定出27個(gè)化合物(圖2、表2),表2所列出的化合物均屬GC-MS鑒定匹配度大于75%的化合物。計(jì)算根莖及根際土中歸一化百分含量大于1%的組分的相似系數(shù),乙醚萃取液中二者的相似系數(shù)為33.33%,乙酸乙酯萃取液中二者的相似系數(shù)為90.00%(表3)?？梢?jiàn),根莖與根際土乙醚萃取液中所含化合物差異較大,前者含量最大的組分為茅術(shù)醇及β-桉葉醇(歸一化百分含量分別為18.26%及38.66%),后者含量最大的組分為十四酸(歸一化百分含量分別為32.69%)。根莖與根際土乙酸乙酯萃取液中所含化合物非常相似,二者含量最大的組分一致,均為鄰笨二甲酸二異丁酯(歸一化百分含量分別為35.36%、35.37%)。2.3乙醇及乙酸乙酯萃取液中-桉葉醇的分離和鑒定β-桉葉醇是不少藥用植物中都含有的倍半萜類(lèi)成分,由于其在蒼術(shù)根莖揮發(fā)油中含量較大,常與其他組分一起用來(lái)作蒼術(shù)定性和定量的指標(biāo)性成分。本實(shí)驗(yàn)在蒼術(shù)根莖水提液的乙醚及乙酸乙酯萃取液中均鑒定到β-桉葉醇,而且含量較大?？紤]到倍半萜類(lèi)成分是極其常見(jiàn)的化感物質(zhì),因此,對(duì)β-桉葉醇進(jìn)行化感作用的生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明,雖然所有處理濃度的β-桉葉醇對(duì)蒼術(shù)種子發(fā)芽率、胚根伸長(zhǎng)均沒(méi)有抑制作用(作為陽(yáng)性對(duì)照的苯甲醛250mg/L時(shí)能顯著抑制蒼術(shù)胚根的生長(zhǎng)),但100及250mg/L的β-桉葉醇能強(qiáng)烈抑制蒼術(shù)胚芽生長(zhǎng),而且250mg/L的β-桉葉醇對(duì)蒼術(shù)胚芽伸長(zhǎng)的抑制作用比同濃度的苯甲醛顯著(p<0.05,表4)。3討論3.1排除了其他植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)以待測(cè)植物部分,或是與它相關(guān)的環(huán)境土壤作為樣品進(jìn)行相關(guān)研究,是植物化感作用研究最常用的方法[8,9,11,12,13,14,8,9,10,11,12,13,14]?？紤]到蒼術(shù)在長(zhǎng)期栽培種植中面臨的最主要的問(wèn)題是自毒現(xiàn)象,本實(shí)驗(yàn)用未種植過(guò)其它植物的土壤作基質(zhì),對(duì)蒼術(shù)進(jìn)行盆栽試驗(yàn),然后進(jìn)行了化感物質(zhì)的提取鑒別及化感作用的生物學(xué)檢驗(yàn),很好地排除了其他植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。實(shí)驗(yàn)中,從蒼術(shù)根莖中共鑒定出化合物20個(gè)次,根際土中共鑒定出化合物27個(gè)次,包括烷、醇、苯、萘、酸及酯等成分,尚不包括更多的含量低未被鑒定出的化合物。迄今為止所發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)幾乎都是植物的次生代謝產(chǎn)物,一般分子量較小,結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單。包括水溶性有機(jī)酸、直鏈醇、脂肪族醛和酮、簡(jiǎn)單不飽和內(nèi)酯、長(zhǎng)鏈脂肪酸和多炔、內(nèi)萜、氨基酸、生物堿、苯甲酸及其衍生物等等。其中最常見(jiàn)的是低分子有機(jī)酸、酚類(lèi)和內(nèi)萜類(lèi)化合物。本實(shí)驗(yàn)所分離鑒定到的化合物中不乏此類(lèi)物質(zhì),證明蒼術(shù)根莖及根際土中均含有抑制其自身生長(zhǎng)的化感物質(zhì),即植物自毒素。為了更好地比較根莖及根際土中所含化合物的相似性,本研究采用Jaccard相似系數(shù)公式,計(jì)算相似度,發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)根莖及根際土中所含主要化合物(歸一化百分含量大于1%)相似度非常高,二者乙酸乙酯萃取液的相似系數(shù)達(dá)到90.00%,乙醚萃取液的相似系數(shù)達(dá)到33.33%,提示土壤中不少極性較大的組分可能是直接來(lái)源于蒼術(shù)分泌物或植物殘?bào)w代謝產(chǎn)物。3.2土壤化感作用實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)根莖水提液能顯著抑制蒼術(shù)種子發(fā)芽率及胚根和胚芽的伸長(zhǎng),但根際土水提液對(duì)蒼術(shù)種子發(fā)芽率及胚根和胚芽的伸長(zhǎng)的抑制作用不顯著。由于GC-MS鑒別到根際土中含有不少有化感作用的物質(zhì),如水溶性有機(jī)酸、直鏈醇、酚酸、簡(jiǎn)單不飽和內(nèi)酯等,因此,推測(cè)根際土對(duì)蒼術(shù)種子自毒作用不顯著與土壤中化感物質(zhì)的積累量不夠有關(guān)。大田栽培時(shí),在生長(zhǎng)的第3年,蒼術(shù)發(fā)病率和死亡率顯著提高,因此,農(nóng)民通常將蒼術(shù)僅種2a就采挖,可能與此有關(guān)。本研究證實(shí)根莖中含量較大的β-桉葉醇對(duì)蒼術(shù)胚芽的伸長(zhǎng)有顯著自毒作用,進(jìn)一步為證實(shí)蒼術(shù)的自毒作用提供了理論支持。研究發(fā)現(xiàn),萜類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)研究較多且活性較強(qiáng)的化感物質(zhì),其在環(huán)境肋迫下含量的變化是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)?？状谷A等在研究以萜類(lèi)物質(zhì)為主要次生代謝產(chǎn)物的勝紅薊化感作用中發(fā)現(xiàn),在缺肥、缺水等逆境下,勝紅薊的化感作用明顯增強(qiáng)。蒼術(shù)根莖提取液中鑒定到的一些倍半萜成分,雖然在根際土提取液中尚未鑒定到,但其在根莖及根際土中的分布代謝,及其在蒼術(shù)自毒現(xiàn)象中的作用的研究,有重要理論及實(shí)踐意義。3.3植物自毒的現(xiàn)狀作者研究發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)栽培中土壤養(yǎng)分及酸度有所下降,但并不是導(dǎo)致其連作障礙的主要原因。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,蒼術(shù)根莖及根際土中都有抑制其自身生長(zhǎng)發(fā)育的化感物質(zhì)。因此,認(rèn)為栽培蒼術(shù)連作障礙與自毒作用有關(guān)。自毒作用是植物通過(guò)根分泌與殘株腐解釋放的有毒化學(xué)物質(zhì)抑制同種植物種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的現(xiàn)象。已有研究表明,水稻、小麥、玉米、甘蔗等禾本科植物和大豆、蠶豆等豆科類(lèi)植物及人工林、茶園中均存在明顯自毒現(xiàn)象。近年來(lái),隨著中藥材規(guī)范化種植的開(kāi)展及中藥材栽培種類(lèi)和面積的不斷擴(kuò)大,連作障礙問(wèn)題顯得日益突出,如人參、地黃、黃連、貝母等等。由于藥用植物通常多年生,且含有大量小分子的次生代謝產(chǎn)物,因而其連作障礙中的植物自毒表現(xiàn)的比普通作物會(huì)更強(qiáng)烈。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不斷與根際土溶液進(jìn)行著物質(zhì)與能量的交換,通過(guò)各種途徑(如地上部分淋溶、根系分泌、植物殘?bào)w分解等)進(jìn)入根際區(qū)的源于植物自身的化學(xué)物質(zhì),直接影響著根際區(qū)土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu),微生物分解代謝又會(huì)產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)