食品酶學(xué)第三章課件

第三章

酶的別離和純化技術(shù)本章重點(diǎn)各種別離方法的操作原理別離方法的應(yīng)用原那么酶別離純化中應(yīng)注意的問題酶制劑的來源

解決問題？如何提高酶的回收率和純度質(zhì)量Purpose？獲得一定量的、不含有或少含雜質(zhì)的酶制劑或者提純?yōu)榻Y(jié)晶，以利于在工業(yè)生產(chǎn)或科學(xué)研究中應(yīng)用

建立一個(gè)可靠和快速的檢測(cè)酶活與純度的方法，并對(duì)整個(gè)別離過程中每一步始終貫穿酶活力的測(cè)定。了解所別離酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點(diǎn)以及酶在細(xì)胞中的存在狀態(tài)。明確原料的特性與數(shù)量。了解各種方法的原理特性和優(yōu)缺點(diǎn)并選擇有效的別離純化方法。各種方法的使用順序安排合理。時(shí)刻防止酶的變性，操作要在溫和或低溫的條件下進(jìn)行。要充分考慮到介質(zhì)與溶液體系中各種因子的影響和實(shí)際的實(shí)驗(yàn)條件。考慮因素本章主要內(nèi)容第一節(jié)酶的別離純化程度第二節(jié)酶的抽提第三節(jié)酶溶液的濃縮第四節(jié)酶的別離提取第五節(jié)酶的純化第六節(jié)酶的提純標(biāo)準(zhǔn)表3－1從E.coli中別離、純化天冬酰胺酶步驟總蛋白含量/mg總活力×107U比活力/U.mg-1

回收率％提純倍數(shù)勻漿1.4×10828.621001酒精粗沉淀4.1×10614.3355017.540℃調(diào)pH4.59.5×10511.41204060上清液DEAE纖維素柱6.5×1059.01403270CM纖維素柱層析3.0×1056.020021100結(jié)晶2.2×1054.822017110重結(jié)晶1.7×1053.822017110從表3－1可知，隨著別離、純化過程，酶的比活力越來越高，提純程度越來越高，其提純倍數(shù)也越來越大，而其總活力、回收率相對(duì)降低。一般試劑級(jí)及藥品級(jí)酶純度要求高，那么采取提純倍數(shù)高的方法。工業(yè)用酶對(duì)純度要求較低，其本錢價(jià)格顯得重要，甚至有時(shí)采用粗酶液。而食品級(jí)酶在整個(gè)別離、純化工程中要注意衛(wèi)生、防止污染，各方面均須綜合考慮。本章主要內(nèi)容第一節(jié)酶的別離純化程度第二節(jié)酶的抽提第三節(jié)酶溶液的濃縮第四節(jié)酶的別離提取第五節(jié)酶的純化第六節(jié)酶的提純標(biāo)準(zhǔn)第二節(jié)酶的提取一、酶原料的選擇二、酶源材料的預(yù)處理三、酶的抽提一、酶原料的選擇1.遵循的原那么酶含量多、干擾物少；來源豐富、保持新鮮；容易得到、提取工藝簡(jiǎn)單；穩(wěn)定性好、平安性好；有綜合利用價(jià)值等。例如：提取生姜蛋白酶應(yīng)該以姜的根部為原料，提取淀粉酶那么應(yīng)以培養(yǎng)的微生物為原料。2.注意的問題1〕酶存在胞內(nèi)酶和胞外酶之分，一般而言，胞內(nèi)酶比胞外酶難于提取。2〕材料不同，同一材料不同部位或不同生長期，酶的含量不相同。如：脂肪氧化酶在大豆中的含量是在花生中含量的100倍。3〕同一種酶在動(dòng)物材料、植物材料、微生物材料中性質(zhì)不同，平安性也不同。4〕選擇到適宜的材料后應(yīng)及時(shí)使用，防止酶的破壞。5〕植物材料具有一些不利于酶提取的因素，如含有較高的纖維素、色素和單寧；細(xì)胞不易破碎；液泡中代謝物復(fù)雜等。6〕動(dòng)物臟器中含有較多的脂肪，容易氧化酸敗導(dǎo)致原料變質(zhì)，影響純化操作和酶的得率。7〕微生物具有種類多、繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)便、誘變?nèi)菀缀筒皇芗竟?jié)地點(diǎn)影響等優(yōu)點(diǎn)，并且可以通過微生物培養(yǎng)方法富集誘導(dǎo)酶，因此已成為制備酶的主要材料之一。8〕采集的材料在正式進(jìn)行酶的提取之前，一般都要進(jìn)行一定的前處理，去除明顯可見的雜質(zhì)和干擾物質(zhì)。二、酶源材料的預(yù)處理〔胞內(nèi)酶〕機(jī)械破碎法物理方法酶解法外表活性劑處理法丙酮粉法機(jī)械破碎法包括研磨法和細(xì)菌磨法研磨法細(xì)菌磨法——此法比研磨法省力，其破碎率也比研磨法效率高。

細(xì)菌磨結(jié)構(gòu)示意圖物理方法超聲波破碎法

滲透壓法

凍融法根本原理是利用超聲波〔10-15KHz〕的機(jī)械振動(dòng)而使細(xì)胞破碎。由于超聲波發(fā)生時(shí)的空化作用，致使液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部產(chǎn)生很大的壓力導(dǎo)致細(xì)胞破碎。先將細(xì)胞置于高滲溶液〔如蔗糖溶液〕中平衡一段時(shí)間后，突然將其轉(zhuǎn)入到低滲緩沖液和水溶液中，細(xì)胞壁會(huì)因?yàn)闈B透壓的突然變化而破碎。將細(xì)胞在低溫〔-15℃〕下冰凍后在在室溫下溶化，如此反復(fù)屢次就能使細(xì)胞壁破裂。此法也只適用于細(xì)胞壁易破的細(xì)胞。凍融過程要迅速，不能很長時(shí)間〔速凍速溶〕酶解法用外源的溶菌酶或細(xì)胞壁分解酶〔如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等〕在一定條件下作用于細(xì)胞而使細(xì)胞壁破碎。例如：用酶法破碎酵母細(xì)胞時(shí)，需要先參加蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)；甘露糖酶可以專一的水解細(xì)胞壁上的甘露糖，使得細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)破壞。另外再參加葡聚糖酶作用于葡聚糖層。最后改變滲透壓使細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)物質(zhì)溶出。外表活性劑處理法在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH值及低離子強(qiáng)度下，外表活性劑〔如SDS、Tween、TritonX〕能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。此法對(duì)膜結(jié)合的酶的提取是相當(dāng)有效的，但對(duì)其它蛋白質(zhì)那么易使之變性，甚至切斷肽鏈。丙酮粉法丙酮粉法的原理是利用丙酮能使細(xì)胞迅速脫水并破壞細(xì)胞壁的作用。具體操作：細(xì)胞離心收集菌體參加冷卻的丙酮液攪拌抽濾反復(fù)用冷丙酮液洗滌置枯燥器中低溫保存。經(jīng)丙酮處理的細(xì)胞干粉稱為丙酮粉。丙酮還能除去細(xì)胞膜局部脂肪，更利于酶的提取。三、酶的抽提What？在酶的別離純化前期，將經(jīng)過處理或破壞的細(xì)胞置于一定溶液中，使被提取的目的酶與其它物質(zhì)別離的過程，包括酶與細(xì)胞固體殘?jiān)膭e離、酶與其他物質(zhì)的別離。酶在細(xì)胞中結(jié)合狀態(tài)和溶解程度不同水溶法有機(jī)溶劑法〔一〕水溶法大局部酶或蛋白質(zhì)能溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿中，其中稀鹽和緩沖液對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大。注意：1.鹽濃度〔即離子強(qiáng)度〕2.pH值3.溫度4.防止蛋白酶或核酸酶的降解作用5.攪拌與氧化鹽濃度絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中參加少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為“鹽溶〞現(xiàn)象。為了提高提取效率，有時(shí)需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中參加蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度〔如參加KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4〕可以增加溶液的極性。pH值蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過酸、過堿應(yīng)盡量防止，一般控制在pH=6～8范圍內(nèi)。提取溶劑的pH值應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。溫度

為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在0℃～5℃的低溫操作。防止酶的作用參加抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶的降解作用。

攪拌與氧化

攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性失活。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的-SH，假設(shè)提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會(huì)使-SH氧化為二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中參加少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。〔二〕有機(jī)溶劑法一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶難溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或局部互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性。

例如：植物種子中的酶——70%-80%乙醇提?。粍?dòng)物細(xì)胞微粒體、線粒體中存在的酶——正丁醇提取，因?yàn)檎〈加H脂性強(qiáng)，可提高酶的溶解度。分配定律的定義——在恒溫、恒壓和比較稀的濃度下，某一溶質(zhì)在兩個(gè)不相混合的液相中的濃度分配比是一個(gè)常數(shù)，即為下式：〔C1/C2〕恒溫、恒壓=K

C1——表示分配到達(dá)平衡后溶質(zhì)在上層有機(jī)相中的濃度C2——表示分配到達(dá)平衡后溶質(zhì)在下層水相中的濃度K——為分配常數(shù)，不同溶質(zhì)在不同溶劑體系中有不同的K值。

從上式可知，K值越大，那么在上層有機(jī)相中溶解度越大；反之，K值越小，那么在下層水相中溶解度越大。如果混合物中各組分k值彼此接近時(shí)，那么需要不斷更換新的溶劑系統(tǒng)，通過屢次抽提便可把各種物質(zhì)別離。本章主要內(nèi)容第一節(jié)酶的別離純化程度第二節(jié)酶的抽提第三節(jié)酶溶液的濃縮第四節(jié)酶的別離提取第五節(jié)酶的純化第六節(jié)酶的提純標(biāo)準(zhǔn)第三節(jié)酶溶液的濃縮

一、真空薄膜濃縮二、冷凍枯燥技術(shù)三、超濾技術(shù)四、透析技術(shù)一、真空薄膜濃縮是把酶溶液置于高度真空條件下成為薄層液膜，增大其蒸發(fā)面積到達(dá)加速蒸發(fā)過程的目的。優(yōu)點(diǎn)：此法由于在真空條件下，可以大大降低熱對(duì)酶分子的作用，減少其熱變性失活。例如：XJT9503高溫中性蛋白酶的制備工藝：采用加熱真空薄膜濃縮，在40℃，-0.094～-0.096MPa真空度下，經(jīng)過45～55min薄膜濃縮，可使發(fā)酵處理液濃縮2～3倍，其酶活力僅損失10%左右。二、冷凍枯燥技術(shù)定義：冷凍枯燥就是把含有大量水分的物質(zhì)，預(yù)先進(jìn)行降溫凍結(jié)成固體。然后在真空的條件下使水蒸汽直接從固體中升華出來，而物質(zhì)本身留在凍結(jié)的冰架子中，從而使得枯燥制品不失原有的固體骨架結(jié)構(gòu)，保持物料原有的形態(tài)，且制品復(fù)水性極好。對(duì)凍干制品的質(zhì)量要求是：生物活性不變、外觀色澤均勻、形態(tài)飽滿、結(jié)構(gòu)牢固、溶解速度快，剩余水分低。凍干工藝包括預(yù)凍、升華和再干凍三個(gè)分階段。適用范圍：冰凍枯燥特別適用于那些對(duì)熱敏感、易吸濕、易氧化及溶劑蒸發(fā)時(shí)易產(chǎn)生泡沫而引起變性的生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶、核酸、抗菌素和激素等。冷凍枯燥技術(shù)冷凍枯燥技術(shù)本卷須知1.樣品溶液：①樣品要溶于水，不含有機(jī)溶劑，否那么會(huì)造成冰點(diǎn)降低。②樣品要予先脫鹽，不可使鹽濃度過高，否那么冰凍后易融化，影響樣品活性，而且不易凍干。③樣品緩沖液在冰凍時(shí)pH可能會(huì)有較大變化，此時(shí)需參加pH穩(wěn)定劑，如糖類和鈣離子等。④樣品溶液的濃度不要過稀，例如蛋白質(zhì)的濃度不低于15mg/mL為宜。2.裝樣品溶液的容器①最好用各種尺寸的培養(yǎng)皿盛樣品溶液，液層不要太厚，以免凍干時(shí)間太長。也可以使用安培瓶和青霉素小瓶。②凍干稀溶液時(shí)會(huì)得到很輕的絨毛狀固體樣品，容易飛散而損失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水紙包住杯口。3.溶液冰凍盡可能用干冰～乙醇低溫浴速凍，如能將盛有樣品溶液的容器邊凍邊旋轉(zhuǎn)形成很薄的冰凍層，那么可以大大加快凍干的速度。4.凍干①樣品全部?jī)龈汕?，不要輕易搖動(dòng)，以防水蒸汽沖散凍干的樣品粉末。②樣品凍干到達(dá)較高真空度時(shí)，容器外部有時(shí)會(huì)結(jié)霜，假設(shè)外霜消失，那么說明樣品已凍干。③凍干后要及時(shí)取出樣品，以免樣品在室溫下停留時(shí)間過長而失活。④關(guān)真空泵時(shí)要先放氣，以免泵油倒灌。放氣時(shí)要緩慢，以免氣流沖散樣品干粉。⑤樣品凍干后要及時(shí)密封冷藏，以防受潮。⑥真空泵要經(jīng)常檢查油面和油色，通常半年或一季度至少要換一次油。三、超濾技術(shù)1.定義：超濾過程是利用膜的篩分機(jī)理，在加壓條件下，把酶溶液通過一層只允許水分子和小分子物質(zhì)選擇性透過的微孔超濾膜，而酶等大分子那么被截留，從而到達(dá)濃縮酶液的目的。超濾膜是具有特定的均勻孔徑和孔隙的多孔薄膜。

表3-2“Diaflo〞超濾膜的物理特性膜代號(hào)截留酶的分子質(zhì)量/U近似平均孔徑/nmXM-30030000014XM-1001000005.5XM-50500003PM-30300002.2PM-20200001.8PM-10100001.5UM-210001.2UM-0.550012.超濾膜的材料醋酸纖維素、各種芳香聚酰胺、聚砜和聚丙烯腈-聚氯乙烯共聚物。3.超濾膜主要形式

折疊平板式、管殼式、螺旋式和中空纖維管式

四種主要超濾膜(1)折疊平板式(2)管殼式(3)螺旋式(4)中空纖維管式1.折疊平板式膜可制成平面濾板，板內(nèi)形成折疊以增加過濾面積，提高液流的湍動(dòng)程度，降低濃差極化，此型式裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，膜面積可達(dá)1500m2，易于清洗，易更換，其缺點(diǎn)是過濾面積的擴(kuò)大會(huì)受到限制。2.管殼式超濾裝置是使待處理的酶溶液在管內(nèi)流動(dòng)，溶劑及低分子溶質(zhì)透過管壁會(huì)聚后排出。

3.螺旋式主要裝置是螺旋卷，是將膜、支撐材料、膜、間隔材料依次迭好，圍繞一中心管卷緊，形成一個(gè)膜組，料液在膜外表通過間隔材料，沿軸向流動(dòng)，使待處理酶液在管內(nèi)錯(cuò)流呈螺旋路線。4.中空纖維管式目前常用的是中空纖維超濾膜。內(nèi)徑為0.5-1mm左右，酶溶液從管內(nèi)流過，溶劑和低分子溶質(zhì)可透過管壁集中后流出。這種裝置過濾面積大，過濾面積高達(dá)3000m2/m3。表3-3中空纖維超濾裝置特性型號(hào)25SIP-3013HF53-20-PM10HF30-20-PM10HF15-43-PM10中空纖維內(nèi)徑/mm0.80.50.51.1公司分析相對(duì)分子質(zhì)量6000100001000010000超濾器外徑/mm890760760760超濾器長度/mm11921092635635超濾有效面積/m24.74.92.81.4允許使用壓強(qiáng)/Mpa3.02.71.752.7最高使用溫度/℃80757575持液量/ml—625340405SIP為旭化成公司產(chǎn)品，使用細(xì)胞色素C為標(biāo)準(zhǔn)物；而HF為Amicon公司產(chǎn)品，使用白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物。四、透析技術(shù)透析是利用半透膜的選擇性在溶液里別離大分子和小分子的一種別離技術(shù)。常常用于除去蛋白或核酸樣品中的鹽、變性劑、復(fù)原劑之類的小分子雜質(zhì)。樣品在膜的一邊，緩沖液在另一邊，小分子即向兩邊擴(kuò)散直到平衡，而大分子那么由于半透膜的阻攔而留在一端，通過不斷更換緩沖液，即可將樣品中要除掉的小分子稀釋到足夠低的濃度。本章主要內(nèi)容第一節(jié)酶的別離純化程度第二節(jié)酶的抽提第三節(jié)酶溶液的濃縮第四節(jié)酶的別離提取第五節(jié)酶的純化第六節(jié)酶的提純標(biāo)準(zhǔn)一、胞外酶〔蛋白酶為例〕的別離提取工藝流程蛋白質(zhì)的別離提純工藝流程二、胞內(nèi)酶〔酰胺酶〕的別離提純工藝流程酰胺酶的別離提取工藝流程圖三、木瓜蛋白酶的提取工藝木瓜蛋白酶是利用未成熟的番木瓜果實(shí)表皮的白色乳汁，提煉而成的一種蛋白水解酶。它是由212個(gè)aa組成，分子量為21000，屬于含巰基〔-SH〕肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性。已被廣泛應(yīng)用于食品、美容化裝品、醫(yī)藥保健品、飼料等多個(gè)行業(yè)。未成熟番木瓜→人工取乳液→參加抗氧化劑→過濾陳雜→壓濾→下一步提純(120目鋼質(zhì)篩)。本章主要內(nèi)容第一節(jié)酶的別離純化程度第二節(jié)酶的抽提第三節(jié)酶溶液的濃縮第四節(jié)酶的別離提取第五節(jié)酶的純化第六節(jié)酶的提純標(biāo)準(zhǔn)第五節(jié)酶的純化一、根據(jù)酶溶解度不同的純化方法二、根據(jù)酶分子大小、形狀不同的純化方法三、根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的純化方法四、根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的純化方法一、根據(jù)溶解度不同方法—沉淀法定義——溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。根本原理——是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而到達(dá)別離的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)。在酶制備中最常用的幾種沉淀方法：1.鹽析法

2.有機(jī)溶劑沉淀3.選擇性沉淀4.等電點(diǎn)沉淀5.有機(jī)聚合物沉淀鹽析法〔1〕定義在溶液中參加中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析〞?！?〕優(yōu)點(diǎn)①本錢低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡(jiǎn)單、平安。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用?！?〕鹽析法沉淀蛋白質(zhì)的根本原理蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿拥模瑿OOH、－NH2和－OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子外表極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個(gè)：即電荷和水膜。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以參加大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀?！?〕中性鹽的選擇常用的中性鹽中最重要的是〔NH4〕2SO4。優(yōu)點(diǎn)：1)溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。2)別離效果好：有的提取液參加適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了4倍。3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。4)價(jià)格廉價(jià)，廢液不污染環(huán)境。〔5〕枯草桿菌α–淀粉酶與雜質(zhì)酶(如蛋白酶)的鹽析沉淀舉例

分段鹽析曲線

W1濃度可除去大局部雜蛋白，此時(shí)目的酶很少沉淀析出，沉淀物別離后再加—定量鹽析劑至W2，此時(shí)，目的酶已根本沉淀析出，而雜蛋白很少混進(jìn)目的酶中。有機(jī)溶劑沉淀法

〔1〕根本原理①降低水溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。②由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用?！?〕沉淀能力一般有機(jī)溶劑的沉淀能力依次為丙酮>異丙醇>乙醇>甲醇。在食品級(jí)酶制劑生產(chǎn)中采用乙醇較多，特別是生產(chǎn)食品級(jí)酶制劑時(shí)對(duì)衛(wèi)生要求有保證?！?〕有機(jī)溶劑的用量常采用相當(dāng)于酶液二倍體積的有機(jī)溶劑沉淀酶蛋白，在分段沉淀時(shí)，有機(jī)溶劑的最適濃度也應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。如果采用逐步提高有機(jī)溶劑濃度，它的用量可按公式計(jì)算：V=V0(S2-S1)/(S-S2)式中V和V0——分別為參加的有機(jī)溶劑體積和原溶液的體積；S、S1、S2——分別為待加的有機(jī)溶劑、原來溶液中含有的有機(jī)溶劑和溶液要到達(dá)的有機(jī)溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)?！?〕優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，溶劑易除去，適于食品級(jí)和藥品級(jí)酶提純。缺點(diǎn)是有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)的氫鍵，易引起變性失活，所以特別要注意攪拌均勻，盡可能減少其變性失活?！?〕本卷須知：1〕酶沉淀別離后，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑的濃度，防止變性。2〕該法沉淀析出的酶一般比鹽析法析出的容易過濾或離心別離，但有機(jī)溶劑沉淀法易使酶變性，所以操作必須在低溫條件下進(jìn)行。3〕添加0.05mol/l的中性鹽可以減少有機(jī)溶劑引起的酶變性，并可以提高酶的別離效果。4〕有機(jī)溶劑沉淀法一般與等電點(diǎn)沉淀法聯(lián)合使用，即操作時(shí)溶液的pH應(yīng)控制在欲別離酶的等電點(diǎn)附近。選擇性變性沉淀法

這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到別離提純。1〕熱變性利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保存目的物在溶液中。2〕外表活性劑和有機(jī)溶劑變性那些對(duì)外表活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀。3〕選擇性酸堿變性利用對(duì)pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。等電點(diǎn)沉淀法

根本原理：蛋白質(zhì)、酶是兩性電解質(zhì)，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，而且不同的酶和蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)。因此可以采用一定的措施使提取液的酸堿度到達(dá)某種酶或蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，使其沉淀與其他物質(zhì)分開，最終到達(dá)別離純化酶的效果。此法主要用于在別離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。有機(jī)聚合物沉淀法〔液—液雙水相抽提法〕根本原理是根據(jù)一種或一種以上親水性聚合物水溶液的不相溶性，細(xì)胞碎片、多糖、酯類、核酸及酶的性質(zhì)不同，在兩相分配系數(shù)不同，因而到達(dá)別離目的。分配系數(shù)K=CT/CB式中K——分配系數(shù)CT——上相酶濃度(活力)CB——下相酶濃度(活力)K是由聚合物濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度及被別離物質(zhì)的量決定的。雙水相的形成：兩種不同水溶性聚合物濃度到達(dá)一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。每一水相中均有很高的含水量，為酶等生物物質(zhì)提供了一個(gè)良好的環(huán)境；其中應(yīng)用最多的是聚乙二醇(polyethyleneglycol簡(jiǎn)寫PEG)[HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)]，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。幾種典型的雙水相系統(tǒng)聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽甲基纖維素聚乙二醇（PEG）磷酸鉀、硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例酶菌種相系統(tǒng)延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/鹽天冬氨酸酶E.coli

PEG/鹽β-半乳糖苷酶E.coli

PEG/鹽亮氨酸脫氫酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脫氫酶Baker’syeastPEG/鹽青霉素?；?/p>

E.coli

PEG/鹽萃取實(shí)例保依地尼假絲酵母菌(Candidaboidinii)發(fā)酵產(chǎn)生的甲酸脫氫酶經(jīng)四次連續(xù)抽提獲得總收率為70％，純度≥70％的產(chǎn)品。別離提純甲酸脫氫酶：1一發(fā)酵罐發(fā)酵酶液2一噴嘴式別離器收集菌體3一玻璃珠破碎細(xì)胞4一熱變性5一第一次液—液雙水相抽提去除細(xì)胞碎片等物質(zhì)6一噴嘴式別離器收集兩相7一第二次液—液雙水相抽提去除核酸、多糖及某些蛋白質(zhì)8一第三次液—液雙水相抽提為進(jìn)一步提純甲酸脫氫酶9一第四次液—液雙水相抽提為甲酸脫氫酶轉(zhuǎn)入上相10一酶產(chǎn)品，在4℃可穩(wěn)定幾個(gè)月本卷須知：A.酶的分子量越大其被沉淀下來所需要的PEG濃度越低。B.酶濃度高，易沉淀，但別離效果差，因此提取液中酶的濃度以小于10mg/ml為好。C.PEG的聚合度越高，沉淀酶時(shí)所需要的濃度越低，但別離效果差，一般常用的是PEG2000-6000。D.PEG對(duì)酶有一定的保護(hù)作用，因此該方法可以在常溫操作。E.溶液的pH越接近酶的pI越易沉淀。F.溶液的離子強(qiáng)度要適宜，一般離子強(qiáng)度小于2對(duì)PEG沉淀效果的影響不大。G.沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。二、根據(jù)酶分子大小、形狀不同的純化方法

1.離心別離技術(shù)2.透析與超過濾技術(shù)3.過濾4.凝膠層析技術(shù)離心別離技術(shù)〔1〕根本原理借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)時(shí)所產(chǎn)生的離心力，而使分子大小、形狀不同的物質(zhì)別離開來?！?〕分類普通離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速<8000r/min，相對(duì)離心力RCF<1×104g高速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速<2.5×104r/min，相對(duì)離心力RCF<1×105g超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速>2.5×104r/min，相對(duì)離心力RCF>〔1-5〕×105g

透析與超過濾技術(shù)

透析與超過濾技術(shù)是利用具有特定大小、均勻孔徑的透析膜或超濾膜的篩分機(jī)理，在不加壓或加壓的條件下把酶提取液通過一層只允許水和小分子物質(zhì)選擇性透過的透析膜或超濾膜，酶等大分子物質(zhì)那么被截留，從而到達(dá)把小分子物質(zhì)從酶提取液中除去〔透析與超過濾〕或同時(shí)到達(dá)濃縮酶液的目的〔超過濾〕。超過濾技術(shù)需要具有加壓系統(tǒng)的超濾儀，而透析技術(shù)那么不需要專一的儀器。超濾柱提純大分子物質(zhì)示意圖壓力：6.9×104~6.9×105Pa膜材料主要有：玻璃紙、再生纖維素、聚酰胺、聚砜等。各種膜別離技術(shù)的特點(diǎn)過濾

在酶的別離中，常需要用過濾法從懸浮液中除去固體材料。小規(guī)模過濾是澄清溶液的好方法。使用助濾劑如C鹽可改善過濾速度，C鹽是硅藻土材料，主要由二氧化硅組成。密理博〔Millipore〕公司開發(fā)出可進(jìn)行大規(guī)模過濾的一種膜過濾片，這種過濾是強(qiáng)迫懸浮液顆粒總是處在膜上面，而液體在壓力下可通過膜，所以懸浮液中的顆粒濃度越來越濃。凝膠層析技術(shù)

原理：凝膠滲透色譜法(GelPermeationChromatography，簡(jiǎn)稱GPC法)，又稱為分子篩層析法。其原理主要是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩的作用，根據(jù)被別離物分子大小不同而別離。待別離系統(tǒng)中小分子物質(zhì)直徑比凝膠孔徑小，可滲入凝膠微孔中，產(chǎn)生阻滯作用大、流程長、移動(dòng)速度慢，最后流出；而大分子由于阻滯作用小，流程短，移動(dòng)速度快，先流出。凝膠過濾原理示意圖

Kd=(Ve–V0)/Vi式中Ve——洗脫液體積V0——凝膠間空隙體積Vi——顆粒內(nèi)部微孔體積Kd——分配系數(shù)，也就是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)。當(dāng)Kd=1，即Ve=V0+Vi，說明該組分可進(jìn)入微孔而最后流出。當(dāng)Kd=0~1之間，Kd值小的先流出，大的后流出。Ve、V0、Vi可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定。該法常用凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠〔Sephadex〕交聯(lián)瓊脂糖凝膠(Sepharose)

聚丙烯酰胺凝膠

交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)

凝膠是以葡聚糖凝膠為原料，交聯(lián)劑為環(huán)氧氯丙烷，在堿性條件下制成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)Sephadex。目前市售SephadexG10至G200共有8種。G表示凝膠保水值，單位為ml／g干膠，G后面的數(shù)字代表凝膠吸水量的10倍。例：G-25表示每克干膠膨脹時(shí)吸水2.5ml，G-200表示每克干膠吸水20ml。Sephadex是一種化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定的基質(zhì)，不溶于水、鹽、弱酸、堿。對(duì)熱穩(wěn)定，在中性條件下，濕態(tài)凝膠于110℃高溫滅菌40min，性能與結(jié)構(gòu)不變，而干態(tài)凝膠可耐受120℃的高溫。交聯(lián)瓊脂糖凝膠(Sepharose)瓊脂糖是從天然瓊脂中別離制備的鏈狀多糖，瓊脂糖凝膠內(nèi)部具有較大的網(wǎng)孔，工作范圍較大，主要用于別離相對(duì)分子質(zhì)量超過40萬的樣品。瓊脂糖的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，瑞典的商品名為Sepharose；美國的為Bio-GelA；英國的為Segavac；丹麥的為Gelarose。

瓊脂糖凝膠具有良好的惰性，不帶電荷，在層析中，對(duì)生物大分子幾乎無非專一性吸附，對(duì)鹽酸胍和尿素等變性劑有很強(qiáng)的抵抗力，但是對(duì)溫度不穩(wěn)定。Sepharose的使用溫度為0-40℃，pH穩(wěn)定范圍4-9。Sepharose有三種型號(hào)：Sepharose2B、4B和6B，數(shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。從2B到6B，瓊脂糖濃度逐漸增加，篩孔逐漸減小，機(jī)械強(qiáng)度依次增大。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺與交聯(lián)劑N，Nˊ—甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的網(wǎng)狀高分子物質(zhì)。以商品名Bio-GelP-為例，P-后的數(shù)字乘以1000，表示該種凝膠可應(yīng)用于別離蛋白質(zhì)的最高分子質(zhì)量，P后面的數(shù)字越大，越適合于大分子的別離。該凝膠不溶于水和普通的有機(jī)溶劑，對(duì)濃鹽、鹽酸胍及尿素有抵抗力，pH值穩(wěn)定范圍為2-11。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性、透明、有較好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，是一種非離子型凝膠，故在酶和蛋白質(zhì)純化中得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)，上述凝膠層析法還用于去除熱原物質(zhì)和制造無離子水，應(yīng)用于脫鹽、高分子溶液的濃縮等。凝膠過濾層析法主要采用柱層析的方式。

柱層析操作過程包括：層析介質(zhì)的平衡、膨潤；裝柱；加樣；護(hù)展以及流出液成分的檢測(cè)和分部收集。凝膠層析的效果通常以洗脫曲線表示，以流出液中的蛋白質(zhì)濃度(如A280)或酶活性相對(duì)洗脫(液)體積(Ve)的圖形表示。分辨率可用RS權(quán)衡，RS=兩峰之間距離／峰寬，當(dāng)RS=1.2時(shí)，通常認(rèn)為已到達(dá)別離效果。

凝膠過濾層析洗脫曲線峰帶：1-Po；2-Ald；3-BSA；4-OVA；5-CTogen；6-RNasA

三、根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的純化方法〔一〕離子交換層析〔二〕電泳離子交換層析

離子交換層析是采用離子交換劑作為固定相，洗脫溶液為流動(dòng)相的一種層析方法。在溶液中，溶質(zhì)離子由于靜電引力的作用，可結(jié)合到離子交換劑的功能基團(tuán)上，同時(shí)置換出功能基團(tuán)上的反離子，使之進(jìn)入流動(dòng)相。交換過程如下式所用：RA+B+——RB+A+離子交換劑指含有解離性離子交換基團(tuán)的高分子化合物，有兩局部組成：一局部是大分子聚合物基質(zhì)主體結(jié)構(gòu)，一局部是具有荷電活性的功能基團(tuán)。根據(jù)離子交換劑所含功能團(tuán)的酸堿性，可分為陽離子交換劑和陰離子交換劑兩大類。根據(jù)交換劑的基質(zhì)性質(zhì)，可分為離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠三種。陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電?？梢耘c溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反響。根據(jù)電荷集團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將陽離子交換劑分為強(qiáng)酸型和弱酸型兩種。其作用原理可表示如下：陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，反離子帶負(fù)電?？梢耘c溶液中的負(fù)電荷化合物或陰離子進(jìn)行交換反響。根據(jù)電荷集團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將陰離子交換劑分為強(qiáng)堿型和弱堿型兩種。其作用原理可表示如下：

離子交換層析之所以能成功地把各種無機(jī)離子、有機(jī)離子或生物大分子物質(zhì)分開，其主要依據(jù)是離子交換劑對(duì)各種離子或離子化合物有不同的結(jié)合力。蛋白質(zhì)、多肽等兩性物質(zhì)當(dāng)pH<pI時(shí)，它們所帶正電荷能與陽離子交換劑結(jié)合；當(dāng)pH>pI時(shí)，它們所帶負(fù)電荷能與陰離子交換劑結(jié)合。根據(jù)基質(zhì)性質(zhì)1〕離子交換樹脂：樹脂是人工合成的疏水性物質(zhì)，如聚苯乙烯、聚苯酚磺酸、聚丙烯酸等。離子交換樹脂的顆粒大小以目表示，目數(shù)越大表示樹脂越細(xì)。2〕離子交換纖維素：由纖維素作主體結(jié)構(gòu)，纖維素上的OH基團(tuán)被功能基團(tuán)取代而形成的，屬于親水型離子交換劑。離子交換纖維素一般為白色，適用于生物大分子的別離純化。3〕離子交換凝膠離子交換凝膠與離子交換纖維素相同，屬于親水型離子交換劑。它是以具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡聚糖或交聯(lián)瓊脂糖為基質(zhì)，接入離子交換功能基團(tuán)而制成的。離子交換凝膠兼有分子篩和離子交換兩種功能，有較高的電荷密度，其總交換量比離子交換纖維素大。但缺乏之處：當(dāng)洗脫液的pH值和離子強(qiáng)度改變時(shí)，大局部離子交換凝膠的基質(zhì)體積會(huì)發(fā)生較大的變化，造成柱體積壓緊、流速降低。三、根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的純化方法〔一〕離子交換層析〔二〕電泳電泳1、定義——帶電顆粒在電場(chǎng)中向電荷方向相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳〔electrophoresis，EP〕。2、分類依據(jù)別離的原理可分為自由界面電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、免疫電泳、毛細(xì)管電泳、印跡轉(zhuǎn)移電泳；依據(jù)支持物的類型可分為醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等；依據(jù)電場(chǎng)的強(qiáng)度可分為高壓電泳和常壓電泳；依據(jù)電泳的方式還可分為單向電泳和雙向電泳。在酶別離純化中最廣泛應(yīng)用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳。與其他凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：1〕在一定濃度下，凝膠透明、有彈性、機(jī)械性能好2〕化學(xué)性能穩(wěn)定、與被別離物不發(fā)生化學(xué)反響3〕對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定4〕幾乎