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文檔簡介
藥品微生物限度檢查法吉林省食品藥品檢驗(yàn)所2008.3.29長春11/10/20231微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受微生物污染程度的方法,也是評(píng)價(jià)生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。檢查項(xiàng)目包括染菌量及控制菌檢查。11/10/20232微生物限度檢查法起草的指導(dǎo)思想較完善檢查法:也是目前國際上常用的一種方法。是以瓊脂平板上的細(xì)菌、霉菌或酵母菌形成的一個(gè)獨(dú)立可見的菌落為計(jì)數(shù)依據(jù)。該法測(cè)定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下所生長的細(xì)菌、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。增加試驗(yàn)的可操作性
使方法更具科學(xué)性,保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。11/10/20233檢驗(yàn)全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,在環(huán)境潔凈度10000級(jí)和局部潔凈度100級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,以防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16292~16294-1996《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。
操作環(huán)境11/10/20234潔凈級(jí)別潔凈級(jí)別塵粒數(shù)/m3浮游菌個(gè)/m2沉降菌個(gè)/0.5h微粒直徑≥0.5um微粒直徑≥5um100≤3,500≤0≤5≤110000≤350,000≤2000≤100≤3100000≤3,500,000≤20,000≤500≤1011/10/20235檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量(g、ml或cm2)一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量(兩個(gè)以上最小包裝單位)的3倍量供試品。除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml;中藥膜劑為50cm2貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量應(yīng)增加10g或10ml11/10/20236供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需用水浴加溫時(shí),溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基,不得超過1小時(shí)。除另有規(guī)定外,常用的供試品制備方法如下:11/10/20237(1)液體供試品取供試品10ml,加稀釋劑至100ml中混勻,作為1:10供試液。水溶性液體制劑可用混合的供試品原液直接作為供試液。(2)固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g加稀釋劑至100ml中,用勻漿儀或其它適宜的方法,混勻后,作為1:10供試液。
供試液的制備11/10/20238非水溶性供試品取供試品5g(5ml),加入司盤805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的無菌溶化混合物(溫度低于45℃)的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后,慢慢加入45℃左右的稀釋劑至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1:20供試液。特殊供試液制備方法11/10/20239特殊供試液制備方法
取供試品10g,加至含玻璃珠和20ml的無菌十四烷酸異丙酯的容器中,充分振搖,使供試品溶解,再加入約45℃的稀釋劑,振搖5-10分鐘,萃取,待油水明顯分層,取其水層作為1:10供試液。十四烷酸異丙酯的滅菌方法:采用薄膜過濾法除菌,選用孔徑為0.22um的脂溶性濾膜,在140℃干熱滅菌2小時(shí)。11/10/202310特殊供試液制備方法非水溶性膜劑供試品取50cm2,剪碎,加適量的稀釋劑(通常為每1ml或每2ml含1cm2),浸泡,振搖,以供試品浸液作為1:10或1:20供試品。11/10/202311特殊供試液制備方法
腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g,加至100mlpH6.8磷酸鹽緩沖液(腸溶制劑)中或pH7.6磷酸鹽緩沖液(結(jié)腸制劑),置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1:10的供試液。11/10/202312特殊供試液制備方法
具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí),應(yīng)消除其抑菌活性后,再依法檢查。常用的方法有:培養(yǎng)基稀釋法離心沉淀集菌法3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘,500轉(zhuǎn)/分離心5分薄膜過濾法中和法11/10/202313菌數(shù)報(bào)告規(guī)則
細(xì)菌數(shù)酵母菌平均菌落數(shù)在30-300,霉菌平均菌落數(shù)在30-100之間的稀釋級(jí)作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定,以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。11/10/202314菌數(shù)報(bào)告規(guī)則
當(dāng)同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí),視兩者比值(比值為高稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值)而定。若比值不大于2,以兩稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌數(shù);若比值大于2但不超過5時(shí),以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。當(dāng)出現(xiàn)比值大于5或高稀釋級(jí)的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級(jí)的菌落數(shù)等異常情況時(shí),應(yīng)查明原因再行檢查,必要時(shí),應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證。11/10/202315菌數(shù)報(bào)告規(guī)則當(dāng)各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均小于30,以最低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長,但平均菌落數(shù)小于1時(shí),以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。11/10/202316菌數(shù)報(bào)告規(guī)則各各稀釋級(jí)菌落平均數(shù)比值菌落數(shù)報(bào)告1:101:102
1:103不可計(jì)不可計(jì)不可計(jì)39240.5164295271411902046604-1.62.210.2--164003775027100異常2405160003800027000240<1011/10/202317操作要點(diǎn)一個(gè)細(xì)菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長繁殖而成,因此供試品中所測(cè)得的菌落數(shù),實(shí)際為菌落形成單位數(shù)(colonyformingunity,cfu)·供試品檢驗(yàn)的全過程必須符合無菌技術(shù)要求。培養(yǎng)基、稀釋劑、實(shí)驗(yàn)器具等的滅菌,按滅菌法(見附錄)的要求采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。11/10/202318操作要點(diǎn)作供試品稀釋時(shí),每一稀釋級(jí)都要更換吸管?!ぜ?xì)菌培養(yǎng)48h,真菌培養(yǎng)72h,計(jì)數(shù)。如菌落極小,不易辨認(rèn)可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間。再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。含蜂蜜、王漿的液體制劑,用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌數(shù),用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定酵菌數(shù),并且合并計(jì)數(shù)。若同一稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。使用滅菌吸管時(shí),管尖不要接觸可能污染的任何容器或用具。供試液稀釋及注皿時(shí)應(yīng)振搖后取均勻的供試液,以免造成實(shí)驗(yàn)誤差。11/10/202319操作要點(diǎn)培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的2/3以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí),塞子必須塞緊,以免松動(dòng)或脫落造成染菌?!づ囵B(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌,避免細(xì)菌繁殖?!缇蟮呐囵B(yǎng)基應(yīng)保存在2-25℃防止被污染,可在三周內(nèi)用畢。已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完,一般開啟后不宜再用,更不要反復(fù)加熱溶化注皿時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)在45±1℃,高于45℃時(shí)易造成細(xì)菌受損或致死,低于45℃時(shí)易凝固,影響混勻,因此使用前可用水浴保溫效果較好。傾注培養(yǎng)基于平皿中與樣品搖勻時(shí),切勿濺到皿蓋邊和皿蓋上,以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。11/10/202320操作要點(diǎn)采用薄膜過濾法時(shí),水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為100ml,沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。每片濾膜的總過濾量不宜過大,以避免濾膜上的微生物受損傷。11/10/202321操作要點(diǎn)●每張濾膜取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液直接過濾或加至適量稀釋劑中混勻,過濾,用適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法及沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”,沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜,濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡,否則影響微生物生長。
11/10/202322操作要點(diǎn)
·菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。菌落數(shù)大于100時(shí),取兩位有效數(shù)字報(bào)告,第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。11/10/202323異常情況處理菌落蔓延:培養(yǎng)中由于一些菌落蔓延生長而影響另一些菌落生長,甚至掩蓋了另一些菌落,干擾計(jì)數(shù)。原因:有動(dòng)力和培養(yǎng)環(huán)境濕度過大造成,給動(dòng)力菌造成泳動(dòng)的條件,促使形成蔓延菌落機(jī)會(huì)增多。11/10/202324加TTC:于傾注培養(yǎng)基前,在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1%TTC溶液1ml混勻后傾注平皿。開蓋干燥:將已凝固的瓊脂平板開蓋,倒置斜放于凈化工作臺(tái)上,開機(jī)1-2h后合蓋,再放培養(yǎng)箱中防止方法11/10/202325防止方法換陶瓦蓋:將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。11/10/202326異常菌數(shù)報(bào)告
在特殊情況下,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的霉菌、酵母菌多于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上菌落數(shù)則以營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、酵母菌菌落數(shù)報(bào)告,反之如玫瑰紅鈉瓊脂平板生長了細(xì)菌,且多于營養(yǎng)瓊脂平板的菌落數(shù),則以玫瑰紅鈉瓊脂平板的細(xì)菌數(shù)報(bào)告11/10/202327
控制菌的檢查大腸埃希菌檢驗(yàn)程序供試品→供試液
↓不少于100ml的膽鹽乳糖增菌液
↓35~37℃18~24h取0.2ml
↓5mlMUG培養(yǎng)基中
↓35~37℃5、24h366nm紫外光下觀察↓加靛基質(zhì)試劑┌────────────┐MUG陽性,靛基質(zhì)陽性MUG陰性,靛基質(zhì)陽性MUG陰性,靛基質(zhì)陰性MUG陽性,靛基質(zhì)陰性↓↓取膽鹽乳糖培養(yǎng)液劃線報(bào)告曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板↓36±1℃18~24h
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陽性陰性↓↓鏡檢、適宜的生化試驗(yàn)報(bào)告↓11/10/202328大腸埃希菌檢驗(yàn)程序
供試品→供試液
↓不少于100ml的膽鹽乳糖增菌液
↓35~37℃18~24h取0.2ml
↓5mlMUG培養(yǎng)基中
↓35~37℃5、24h366nm紫外光下觀察↓加靛基質(zhì)試劑┌────────────┐MUG陽性,靛基質(zhì)陽性MUG陰性,靛基質(zhì)陽性MUG陰性,靛基質(zhì)陰性MUG陽性,靛基質(zhì)陰性↓↓取膽鹽乳糖培養(yǎng)液劃線報(bào)告曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板↓36±1℃18~24h
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陽性陰性↓↓鏡檢、適宜的生化試驗(yàn)報(bào)告↓報(bào)告11/10/202329注意事項(xiàng)配制MUG培養(yǎng)基時(shí),務(wù)必校正pH值,滅菌后pH不得過7.4否則pH值偏高,MUG分解本身則顯熒光。供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中,培養(yǎng)時(shí)間一般在4h、24h觀察是否產(chǎn)生熒光,如熒光很微弱,不能準(zhǔn)確判斷時(shí),可延長培養(yǎng)時(shí)間至48h再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同,對(duì)底物和底物的濃度反應(yīng)的差異;培養(yǎng)基中選擇因子的影響;培養(yǎng)時(shí)間、溫度;pH的改變;大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等,對(duì)結(jié)果的判斷亦有影響。11/10/202330注意事項(xiàng)觀察供試品MUG管時(shí),可與陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管同時(shí)在366nm紫外燈下觀察。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板上生長的可疑菌落,務(wù)必挑選2-3個(gè)以上菌落分別做IMViC試驗(yàn)鑒別。在IMViC試驗(yàn)中,以滅菌接種環(huán)沾取菌苔,首先接種于枸椽酸鹽瓊脂斜面上,然后再接種于蛋白胨水等其它培養(yǎng)基上,切務(wù)將培養(yǎng)基帶入枸椽酸鹽瓊脂斜面上,以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。11/10/202331大腸菌群大腸菌群作為水質(zhì)糞便污染的指示菌已有80多年歷史。大腸菌群的定義:是指37℃生長時(shí)能發(fā)酵乳糖,在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌,符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希氏桿菌屬外,還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸椽酸菌屬、克雷伯菌屬等,實(shí)際上基本包括人和了正常家畜腸道內(nèi)的全部需氧的革蘭陰性桿菌,較大腸埃希菌更具代表性,且存活時(shí)間較長。故檢出大腸埃希菌,一般認(rèn)為藥品受糞便的近期污染;而檢出大腸菌群,則表示藥品受糞便的近期或遠(yuǎn)期污染。以大腸菌群作為口服藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的控制菌,具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義,更能反映藥品的衛(wèi)生質(zhì)量。11/10/202332操作方法取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支,分別加入1:10供試液1ml(供試品量0.1g或0.1ml),1:100供試液1ml(供試品量0.01g或0.01ml),1:1000供試液1ml(供試品量0.001g或0.001ml),同時(shí)作陰性對(duì)照,各管置36±1℃培養(yǎng)18-24h,陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長。11/10/202333結(jié)果判斷
乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長,或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣(或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣)→報(bào)告未檢出大腸菌群;如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣,應(yīng)做確證試驗(yàn),將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管劃線接種于EMB或麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)18-24h,如平板上無菌落生長可判該管未檢出大腸菌群。如平板上有菌落生長并與藥典所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,鏡檢為革蘭陰性無芽孢桿菌的菌落,應(yīng)取上述平板上的可疑菌落4-5個(gè)各接種1支乳糖發(fā)酵管,培養(yǎng)24-48h,凡產(chǎn)酸產(chǎn)氣,革蘭陰性無芽孢桿菌,判該管檢出大腸菌群,反之判該管未檢出大腸菌群。11/10/202334沙門菌檢驗(yàn)程序供試品10g(10ml)
↓200ml的營養(yǎng)肉湯中
↓35~37℃18~24h四硫磺酸鹽增菌液
↓35~37℃18~24hDHL,EMB或MacC↓35~37℃18~24h┌────────────┐無典型菌落三糖鐵瓊脂(TSI)↓↓35~37℃18~24h報(bào)告┌────────────┐斜面未見紅色(斜面黃色)斜面紅色(黃色)底層未見黃色(底層無黑色)底層黃色(黑色)↓↓血清凝集、生化試驗(yàn)報(bào)告11/10/202335注意事項(xiàng)
①在作氰化鉀試驗(yàn)時(shí),應(yīng)注意密封管口,夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行,防止氰化鉀分解,產(chǎn)生氫氰酸逸出,致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低,不能抑制細(xì)菌生長,造成假陽性。②氰化鉀為劇毒品,操作時(shí)須謹(jǐn)慎,用后培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml去毒,然后再滅菌、洗滌。11/10/202336銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序
供試品
↓
供試液↓BL增菌液↓35~37℃18~24h溴代十六烷三甲胺平板
↓35~37℃18~24h氧化酶、革蘭染色鏡檢↓┌────────────┐氧化酶陰性氧化酶陽性非革蘭陰性無芽孢桿菌革蘭陰性無芽孢桿菌↓↓綠膿菌素報(bào)告┌────────────┐綠膿菌素陽性綠膿菌素陰性↓↓生化試驗(yàn)報(bào)告11/10/202337注意事項(xiàng)
銅綠假單胞菌污染藥品后,因生產(chǎn)工藝和藥物的影響,在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢,在挑取疑似菌落時(shí),宜取2~3個(gè)以上菌落,分別進(jìn)行檢驗(yàn),以提高銅綠假單胞菌的檢出率。做氧化酶試驗(yàn)時(shí),試驗(yàn)菌苔必須新鮮,陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)不可靠試驗(yàn)應(yīng)避免與鐵、鎳等金屬接觸,不可用普通接種針(環(huán))(白金材料除外),挑取菌苔,否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。11/10/202338注意事項(xiàng)試劑宜新鮮配制,放置過久,二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺氧化變色不可用。該反應(yīng)需在有氧條件下進(jìn)行,勿滴加試劑過多,以免浸沒培養(yǎng)物,使之與空氣隔絕,造成假陰性反應(yīng)。綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征,但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響,除菌株差異及變異外,培養(yǎng)條件是重要因素,溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影響色素產(chǎn)生。培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事先測(cè)試,選用適宜品牌,實(shí)驗(yàn)時(shí)并用陽性菌株作對(duì)照試驗(yàn)。11/10/202339金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序供試品
↓
供試液↓營養(yǎng)肉湯(亞碲酸鈉肉湯)↓35~37℃18~24h卵黃氯化鈉平板或甘露醇氯化鈉平板
↓35~37℃18~24h┌────────────┐無菌落營養(yǎng)瓊脂斜面↓↓35~37℃18~24h報(bào)告血漿凝固酶試驗(yàn),革蘭染色鏡檢11/10/202340注意事項(xiàng)
金黃色葡萄球菌在上述三種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響或非典型菌株存在,可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查,對(duì)非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)做金黃色葡萄球菌的篩查,以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基存放時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間影響色素產(chǎn)生,故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。培養(yǎng)時(shí)間宜48h以上。做血漿凝固酶試驗(yàn)應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用舊培養(yǎng)物及血漿易導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。此外,觀察結(jié)果時(shí)不宜搖動(dòng)試管,因凝固初期凝塊不結(jié)實(shí)易破壞,引起假陰性反應(yīng)。11/10/202341梭菌的檢驗(yàn)程序供試液10ml2份(1份置80℃水浴保溫10分)↓100ml皰肉培養(yǎng)基↓厭氧培養(yǎng)72~96h┌────────────┐未渾濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣0.2ml↓↓報(bào)告含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板↓厭氧培養(yǎng)48~72h┌────────────┐無菌生長過氧化氫酶試驗(yàn)↓
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