馬間充質干細胞-征求意見稿

本文件適用于馬間充質干細胞的生產和檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過本文件的規(guī)范性引用而成為本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。中華人民共和國獸藥典BB/T27621-2011馬鼻肺炎診斷技術BBBB/T27980-2011馬病毒性動脈炎診斷技術3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。一類貼壁培養(yǎng)后呈成纖維細胞樣形態(tài)(紡錘形和梭形)、可在體外自我更新并具有成骨、成脂、成軟骨等分化能力的干細胞。注：馬間充質干細胞可由多種組織(如骨髓、臍帶、胎盤、羊膜、脂肪、臍帶血等)分離獲得，也可以通過分化或轉分化等方式獲得；不同來源的馬間充質干細胞在基因表達和分化能力方面存在差異。4縮略語EIA——馬傳染性貧血(EquineinfectiousEVA——馬病毒性動脈炎(equineviralarteriINF-Y——干擾素丫(Interferongamma)5.2.2染色體核型正常核型成為64,XX或64,XY。5.2.3細胞存活率未凍存細胞存活率≥95%,且凍存復蘇后細胞存活率≥905.2.5免疫調節(jié)HUAWEI6.6.2抑制T細胞增殖7.4判定規(guī)則10.3運輸10.3.2凍存細胞應在于冰或低于-130℃條件下運輸，非凍存細胞建議在4℃~25℃下運輸，中央5個中格(即80個小格)計數。當遇到位于大格線上的細胞，一般只計數大方格的上方和左線上的細胞(或只計數下方和右方線上的細胞)。按照步驟B,3.2~BB.4細胞存活率按式(B,1)X一細胞存活率；s一染色的細胞數，計算兩次計數細胞存活率結果的平均值，記為細胞平均存活率。B.5精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。用洗滌液重懸細胞，然后通過40μm濾網轉移到流式管中，按流式細胞儀(B.1.1)應用首先根據細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群1,排除死細胞和其他雜細胞，然后根據Isotype對照組熒光強度，在分群1的基礎上畫出陽性細胞群2,排除沒有被熒光抗根據附錄A方法測定，使用血球計數板(E,1.1)及顯微鏡(E,1.2)計算細胞懸液活細胞濃度。然后進行CFSE標記，根據CFSE產品說明書進行。E.3.2T細胞與馬間充質干細胞共培養(yǎng)E.3.2.1T細胞增殖根據附錄A方法測定，使用血球計數板(,1.1)及顯微鏡(E,1.2)計算馬T細胞懸液活增殖，設立未用植物凝集素(E,2.4)刺激的T細胞培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)96h,用于檢測刺激后T細胞增殖百分比A。E.3.2.2馬間充質干細胞抑制T細胞增殖利用消化酶消化馬間充質干細胞并制備成單細胞懸液，根據附錄A方法測定，計算T細胞與馬間充質干細胞懸液活細胞濃度。馬間充質干細胞按2×105細胞/mL接種，細胞貼壁后，將T細胞按5:1(T細胞：馬間充質干細胞)的比例進行共培養(yǎng)，并用(2～5)pg/mL的植物凝集素(E.2.4)刺激T細胞增殖，培養(yǎng)96h,用于檢測馬間充質干細胞抑制后T細胞增殖E.3.3T細胞收集并檢測收集培養(yǎng)后的T細胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液(E,2.1)并使用水平離心機離心(E,1.3)洗滌2次，通過40μm濾網轉移到流式管中，按流式細胞儀(E.1.4)應用手冊上機檢測。E.3.4圈門設定原則首先根據細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群1,排除死細胞和其他雜細胞，排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞。然后根據未用植物凝集素刺激的T細胞的熒光強度，在分群1的基礎上畫出CFSE母代細胞位置，根據CFSE母代細胞位置畫出子代細胞群2(即為T細胞增E.4結果分析得到的檢測結果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算馬間充質干細胞對T抑制率按式(,1)進行計算：抑制T細胞分泌IFN-Y、TNF-a檢測胞內因子染色法F.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。F.23臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液(F.2.1)稀釋至0.4%(質量濃度)。F.3.1T細胞分離F.3.21T細胞炎癥因子分泌根據附錄A方法測定，使用血球計數板，1.1)及顯微鏡(,1.2)計算T細胞懸液活細胞濃度，按，1×10°細胞/πL接種培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結束培養(yǎng)前4h～6h往培養(yǎng)體系添加50ng/mL佛波酯(2.4)、10μg/mL布雷非德菌素AC,2.7)和1μg/mL離子霉素(g,2.8),用于檢測IFN-Y陽性的T細胞比例A,和TNF-a陽性的T細胞比例A。F.3.22馬間充質干細胞抑制T細胞炎癥因子分泌利用0.25%EDTA-胰酶消化液消化馬間充質干細胞并制備成單細胞懸液，根據附錄A方法測定，使用血球計數板G1.1)及顯微鏡1.2)計算T細胞與馬間充質干細胞懸液活細胞濃度，馬間充質干細胞按2×10細胞/mL接種，細胞貼壁后，將T細胞按5:1(T細胞：馬間充質干細胞)的比例進行共培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結束培養(yǎng)前4h~6h,往培養(yǎng)體系添加50ng/nL佛波酯(F,2.4)、10Hg/mL布雷非德菌素A(F,2.7)和1μg/mL離子霉素(,2.3),用于檢測馬間充質干細胞抑制后IFN-Y陽性的T細胞比例C和TNF-Q陽性的T細胞比例C?。F.33T細胞收集并標記收集培養(yǎng)后的T細胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液(,2.1)并使用水平離心機離心(E,1.3)洗滌2次。用4%多聚甲醛(F,2.10)固定細胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液g.2.1)并使用水平離心機離心(F.1.3)洗滌1次。使用0.1%～0.2%皂苷(F.2.9)處理穿膜，然后孵育IFN-Y和TNF-Q抗體，用適量無菌磷酸鹽緩沖液C,2.1)并使用水平離心機離心(,1.3)洗滌1次。最后通過40Hm濾網轉移到流式管中，按流式細胞儀應用手冊上機檢測。首先根據細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群1,排除死細胞和其他雜細胞，然后根據Isotype組熒光強度，在分群1的基礎上畫出IFN-Y陽性的細胞群2和TMF-Q陽性的細胞群3,排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞。F.4結果分析得到的檢測結果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算馬間充質干細胞對T細胞分泌IFN-Y、TMF-Q的抑制率。TNF-α抑制率=(A?-C?)/A×1脂滴染色根據油紅0染色試劑盒說明書進行。(規(guī)范性)成瘤性檢測免疫缺陷小鼠檢測法J.1儀器和設備J.1.1血球計數板.J.1.3水平離心機本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。J.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。J.2.20.25%EDTA-胰酶。J.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液(I2.1)稀釋至0.4%(質量濃度)。J.3檢測步驟J.3.1細胞樣品的準備使用水平離心機(I,1.3)離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。根據附錄A方