食品中金黃色葡萄球菌檢測方法依據(jù)

食品中金黃色葡萄球菌檢測方法依據(jù)食品中金黃色葡萄球菌的檢測方法范圍本標準規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢測方法。本標準第一法適用于金黃色葡萄球菌的定性檢測；第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數(shù)。第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數(shù)。設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其它設備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。冰箱：2℃～5℃。恒溫水浴箱：37℃～65℃。天平：感量0.1g。均質(zhì)器。振蕩器。無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器。無菌錐形瓶：容量100mL、500mL。無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。注射器：0.5mL。pH計或pH比色管或精密pH試紙。全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。（BDCrystal或Phoenix）。比濁儀。（BDPhoenix比濁儀，貨號440910）。比濁儀定標盒。（BDPhoenix定標盒，貨號440911）。培養(yǎng)基和試劑10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯。7.5%氯化鈉肉湯。血瓊脂平板。（BD貨號腦心浸液瓊脂241830胰蛋白大豆瓊脂236950作為基礎加兔血漿）Baird-Parker瓊脂平板。（BD貨號276840）腦心浸出液肉湯(BHI)。（BD貨號237400）稀釋液：磷酸鹽緩沖液。(BD貨號211544)營養(yǎng)瓊脂小斜面。（BD貨號21）革蘭氏染色液。（BD貨號212539）無菌生理鹽水。第一法金黃色葡萄球菌的定性檢驗檢驗程序金黃色葡萄球菌定性檢驗程序見圖1：檢樣檢樣25g（mL）樣品＋225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯，均質(zhì)Baird-Parker平板，血平板涂片染色BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面觀察溶血血漿凝固酶試驗報告 36℃±1℃ 18h～24h 36℃±1℃血平板18h～24hBaird-Parker平板18h～24h或45h～48h 36℃±1℃ 18h～24h圖1金黃色葡萄球菌檢驗程序操作步驟樣品的處理稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。增菌與分離培養(yǎng)將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。鑒定染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽孢，無莢膜，直徑約為0.5μm～1μm。挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。然后挑取可疑菌落適用Crystal腸桿菌/非發(fā)酵菌鑒定試劑盒進行生化鑒定。結(jié)果與報告結(jié)果判定：符合5.2.3、5.3，可判定為金黃色葡萄球菌。結(jié)果報告：在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。第二法金黃色葡萄球菌的Baird-Parker平板計數(shù)檢驗程序金黃色葡萄球菌平板計數(shù)程序見圖2檢樣檢樣25g（mL）樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2～3個連續(xù)的適宜稀釋度的樣品勻液，接種Baird-Parker平板計數(shù)及Crystal生化檢驗報告 36℃±1℃45h～48h圖2Baird-Parker平板法檢驗程序操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管重復吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。按8.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。樣品的接種根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別加入三塊Baird-Parker平板，然后用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。培養(yǎng)在一般情況下，涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)1h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)，45h～48h。典型菌落計數(shù)和確認金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20CFU～200CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。只有一個稀釋度平板的菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；最低稀釋度平板的菌落數(shù)小于20CFU且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數(shù)不在20CFU～200CFU之間，應計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；以上按公式（1）計算2個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間，按公式（2）計算。從典型菌落中任選5個菌落（小于5個全選），分別按5.3.2做血漿凝固酶試驗。結(jié)果計算公式（1）：式中：T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)； A——某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；B——某一稀釋度血漿凝固酶陽性菌落數(shù)；C——某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)；d——稀釋因子。公式（2）：A1B1C1+A2B2C2T=1.1d式中：T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)；C2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)1.1——計算系數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。結(jié)果與報告根據(jù)Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數(shù)，按9中公式計算，報告每g（mL）樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。第三法金黃色葡萄球菌MPN計數(shù)檢驗程序金黃色葡萄球菌MPN計數(shù)方法見圖3檢樣檢樣25g（mL）樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液，各吸取1mL分別接種于3管10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯接種Baird-Parker平板血漿凝固酶試驗查MPN表報告結(jié)果36℃±1℃ 45h～48h圖3金黃色葡萄球菌MPN法檢驗程序操作步驟樣品稀釋按照8.1進行。接種和培養(yǎng)根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液接種到10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯管，每個稀釋度接種3管，將上述接種物于36℃±1℃培養(yǎng)45h～48h。用接種環(huán)從有細菌生長的各管中，移取1環(huán)，分別接種Baird-Parker平板，36℃±1℃培養(yǎng)45h～48h。典型菌落確認見8.4.1從典型菌落中至少挑取1個菌落接種到BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。進行血漿凝固酶試驗。結(jié)果與報告計算血漿凝固酶試驗陽性菌落對應的管數(shù)，查MPN檢索表（見附錄C），報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數(shù)，以MPN/g（mL）表示。附錄培養(yǎng)基和試劑10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯成分胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g氯化鈉100.0g磷酸氫二鉀2.5g丙酮酸鈉10.0g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mLpH7.3±0.2制法將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。7.5%氯化鈉肉湯。成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉75g蒸餾水1000mLpH7.4制法將上述成分加熱溶解，pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓蒸汽滅菌15min。血瓊脂平板成分腦心浸液瓊脂或胰蛋白大豆瓊脂 52g/40g兔血漿（無菌3.8%檸檬酸鈉：兔全血=1:4） 50mL～100mL蒸餾水 1000mL制法加熱溶化瓊脂，冷卻至50℃，以無菌操作加入兔血漿，加熱溶解，搖勻，傾注平板。Baird-Parker平板成分Baird-Parker基礎瓊脂干粉 63g蒸餾水 1000mL制法稱取Baird-Parker基礎瓊脂干粉63g于1000mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH7.0±0.2，高壓蒸汽滅菌15min。腦心浸