小球藻生長(zhǎng)因子提取及其生理活性研究

小球藻生長(zhǎng)因子提取及其生理活性研究

1小球藻的活性提取物小球藻是綠藻門的一種普生細(xì)胞藻類。由于其豐富、平衡的營(yíng)養(yǎng)成分，它通常被用作食品、輕工業(yè)和食品添加劑，并被用于處理污染。小麥藻生長(zhǎng)因子（gf）也被稱為小麥藻精，是其細(xì)胞活性物質(zhì)。它含有氨基酸、沉積物、糖、茶多酚、蛋白質(zhì)、酶、維生素、礦酸等養(yǎng)分。它被稱為“類環(huán)境影響”。在國(guó)外，它對(duì)醫(yī)療功能的研究很多。其藥理作用主要包括激活淋巴結(jié)、提高人體免疫能力、激活人細(xì)胞、加速兒童生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗外來疾病的入侵，促進(jìn)人體受傷組織的恢復(fù)。gacf對(duì)有機(jī)物和重金屬中毒具有快速恢復(fù)的作用，對(duì)潰瘍、高血壓和心血管疾病也有預(yù)防和治療的作用。最近，小麥藻生長(zhǎng)因子提取技術(shù)和生理活性的研究已成為英國(guó)、美國(guó)、日本和臺(tái)灣的研究熱點(diǎn)。本文在各種小麥藻破壁法的基礎(chǔ)上，研究了具有誘導(dǎo)參數(shù)的啤酒母乳素母乳素的生理效應(yīng)，從而縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本。2材料和方法2.1啤酒酵母糖度的測(cè)定以粉核小球藻(Chlorellavulgaris)(福建莆田神州生物公司提供)、啤酒酵母(Saccharomycetecerevisiae)(本校微生物實(shí)驗(yàn)室保存)為供試材料.粉核小球藻培養(yǎng)基為NH4Cl0.475g,KH2PO40.136g,CaCl20.02g,EDTA0.001g,MgSO40.024g,Na2CO30.002g,加水至1000ml,調(diào)pH7.0,121℃高壓滅菌30min.啤酒酵母采用麥芽汁培養(yǎng)基:稱取500g麥芽粉,加水至2000ml,于水浴鍋內(nèi)65℃糖化2h,雙層紗布過濾,濾液煮沸30min,4層紗布過濾,用糖度計(jì)測(cè)定外觀濃度為12Bx,分裝,121℃濕熱滅菌30min備用.崩解液:NaCl0.9g,Na2HPO4·2H2O2.61g,檸檬酸·H2O0.36g,加水至100ml,121℃高壓滅菌30min.2.2細(xì)胞數(shù)的測(cè)定按1∶10接種小球藻,28℃光照培養(yǎng)1周,長(zhǎng)至濃綠,無菌條件下取500ml搖勻,離心10min(4000r·min-1),棄上清液,沉淀用無菌水離心洗滌3次,得純凈無菌藻泥.1)機(jī)械勻漿破壁法:用無菌水將無菌藻泥稀釋,使小球藻的密度達(dá)到1010CFU·ml-1,無菌條件下用高速組織搗碎機(jī)勻漿30s(12000r·min-1),3次重復(fù),取樣,顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)完整細(xì)胞數(shù);2)機(jī)械研磨破壁法:將無菌藻泥在研缽中加少量石英砂研磨30min;3)超聲波破壁法:用超聲波破碎儀進(jìn)行處理;4)凍融破壁法:用崩解液將無菌藻泥稀釋,將樣品置4℃冰箱預(yù)凍2h,再置-22℃冰箱冷凍過夜,次日取出,加水融化,融化至一半時(shí)劇烈振搖30min,再放回-22℃冰箱冷凍過夜,重復(fù)12次.將破壁后的小球藻轉(zhuǎn)移至無菌離心管中,8000r·min-1離心15min,上清液移至無菌透析袋透析除鹽,得細(xì)胞活性物質(zhì)濃縮液.用1ml無菌注射器以0.5ml·支-1分裝至2ml安培瓶中,冷凍干燥無菌封口,得細(xì)胞活性物質(zhì)凍干品(圖1).2.3啤酒酵母菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)取7支裝有9ml麥芽汁培養(yǎng)基的試管,每支分別接種1ml啤酒酵母菌液,按2.0%、1.0%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%加入細(xì)胞活性物質(zhì)凍干品,搖勻,28℃恒溫箱培養(yǎng)48h,觀察泡沫高度變化,3次重復(fù).取6瓶裝有100ml麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶,每瓶分別接種1ml啤酒酵母菌液,取1瓶作為對(duì)照,另5瓶分別加入細(xì)胞活性物質(zhì)1、0.5、0.25、0.1和0.05g,搖勻,28℃恒溫箱培養(yǎng),每6h稱重一次,直至恒重,3次重復(fù).取3支裝有9ml麥芽汁培養(yǎng)基的試管,每支分別接種1ml啤酒酵母菌液,取1支作為對(duì)照,另2支分別加入0.1和0.05g的細(xì)胞活性物質(zhì)凍干品,搖勻,28℃恒溫箱培養(yǎng),于24和48h取樣計(jì)數(shù),3次重復(fù).取3支裝有9ml麥芽汁培養(yǎng)基的試管,每支分別接種1ml啤酒酵母菌液,取1支作為對(duì)照,另2支分別加入0.1和0.05g的細(xì)胞活性物質(zhì)凍干品,搖勻,28℃恒溫箱培養(yǎng).發(fā)酵7d后,置4℃冰箱保存,于30、60和90d取樣制片(加次甲基藍(lán)染色),并用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)染色酵母菌數(shù),計(jì)算酵母死亡率,3次重復(fù).啤酒酵母菌死亡率=染色酵母菌數(shù)/總菌數(shù)×100%.U=(lnNt2-lnNt1)/(t2-t1)2.4處理數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析和處理.3結(jié)果與分析3.1超聲波、凍融法破壁效果對(duì)比小球藻體積小,細(xì)胞壁堅(jiān)固,破壁較難,破壁成為提取活性成分的關(guān)鍵.從表1可以看出,超聲波法、凍融法與機(jī)械勻漿法、機(jī)械研磨法相比差異達(dá)到極顯著水平,機(jī)械勻漿法與機(jī)械研磨法差異不顯著.可見,以凍融法破壁效果最佳(圖2).3.2活性物質(zhì)添加量對(duì)啤酒酵母菌生長(zhǎng)的影響從表2可以看出,不同濃度小球藻活性物質(zhì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)具有顯著影響,其比生長(zhǎng)速率明顯高于對(duì)照.在培養(yǎng)基中添加0.5%的提取物,發(fā)酵24h后啤酒酵母菌數(shù)是對(duì)照的1.8倍,48h后是對(duì)照的6.8倍.說明細(xì)胞活性物質(zhì)具有提高酵母菌細(xì)胞分裂速度和促進(jìn)生長(zhǎng)的作用(圖3).3.3活性物質(zhì)添加量對(duì)啤酒酵母泡沫高度的影響從圖4和圖5可以看出,細(xì)胞活性物質(zhì)具有促進(jìn)啤酒酵母的發(fā)酵、提高啤酒酵母產(chǎn)氣量的作用,且泡沫高度隨活性物質(zhì)添加量的增加而增加.當(dāng)添加量達(dá)到0.5%以上時(shí),增加量趨于平緩.3.4小球藻活性提取物添加量對(duì)酵母糖代謝的影響由圖6可見,在加入細(xì)胞活性物質(zhì)的培養(yǎng)基中,啤酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的CO2與對(duì)照不同,并且隨著添加量的增加,CO2失重增加.當(dāng)添加量達(dá)到0.5%以上時(shí),失重增加量趨于平緩,表明適量的小球藻活性提取物有利于提高酵母對(duì)糖類物質(zhì)的利用和產(chǎn)酒精能力.3.5小球藻活性提取物對(duì)酵母菌死亡率的影響從表3可以看出,加入0.25%和0.5%的細(xì)胞活性物質(zhì)凍干品,酵母菌30d后的死亡率分別比對(duì)照減少34%和50%,60d后分別比對(duì)照減少20%和34%,90d后分別比對(duì)照減少13%和27%,表明小球藻活性提取物能延長(zhǎng)該酵母的保存期.4小球藻細(xì)胞活性物質(zhì)目前,小球藻的破壁提取主要采用機(jī)械勻漿法、機(jī)械研磨法、超聲波法、酶解法以及酸堿浸提法等.酶解法效果較好,但成本較高,難以在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用.機(jī)械勻漿法、機(jī)械研磨法、超聲波法等由于小球藻的細(xì)胞壁為堅(jiān)固的纖維素,且體積微小,破壁率低,不能充分利用.酸堿浸提法產(chǎn)率較高,但活性物質(zhì)易被破壞.通過對(duì)小球藻幾種破壁方法的比較發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凍融法破壁率較高,且能最大程度地保持小球藻活性成分的活性,活性物質(zhì)損傷少,提取工藝簡(jiǎn)單.凍融法破壁率高的主要原因可能是反復(fù)凍融小球藻使其細(xì)胞壁結(jié)為冰晶,而后又解凍,連續(xù)處理多次使小球藻細(xì)胞壁被拉傷,通透性增加,細(xì)胞較易破裂.小球藻細(xì)胞活性物質(zhì)含有氨基酸、多糖、蛋白質(zhì)、維生素等功能成分,具有活化細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂作用.對(duì)小球藻細(xì)胞活性物質(zhì)對(duì)啤酒酵母生理效應(yīng)的研究表明,小球藻細(xì)胞活性物質(zhì)可顯著增加啤酒酵母發(fā)酵過程中的酵母菌數(shù),促進(jìn)啤酒酵母的生長(zhǎng)和繁殖,加速酵母發(fā)酵進(jìn)程,增加酵母發(fā)酵的泡沫高度、產(chǎn)氣量,縮短酵母菌發(fā)酵的延滯期,快速啟動(dòng)發(fā)酵,提前到達(dá)產(chǎn)氣高峰.同時(shí),小球藻提取物能提高酵母發(fā)酵過程抗雜菌能力,且細(xì)胞活性物質(zhì)可以使酵母菌的降糖更徹底、糖的利用率更高.此外,添加小球藻細(xì)胞活性物質(zhì)還可延緩酵母菌的死亡時(shí)間,在酵母