黃酒發(fā)酵屑中乳酸桿菌培養(yǎng)及初步鑒定

黃酒發(fā)酵屑中乳酸桿菌培養(yǎng)及初步鑒定

1材料和方法1.1儀器、試劑和培養(yǎng)基紹興美酒、傳統(tǒng)生麥曲、機(jī)制生麥曲、酒藥、先田酒母、速酒母、傳統(tǒng)糖酒發(fā)酵桿和酒精中毒酒的提取機(jī)制需要無菌處理。理化分析用試劑外購。MRS培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、米曲汁培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、米曲汁碳酸鈣培養(yǎng)基等等配培養(yǎng)基的試劑外購;“X”物質(zhì)外購。壇裝紹興加飯酒必須符合《紹興酒》GB/T17946-2008國家標(biāo)準(zhǔn),傳統(tǒng)生麥曲、機(jī)制生麥曲、酒藥、淋飯酒母、速釀酒母、傳統(tǒng)加飯酒發(fā)酵醪、機(jī)制加飯酒發(fā)酵醪為生產(chǎn)正常的批次。1.2儀器設(shè)備與設(shè)備0.01g電子天平JH3102,上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱SPX-250B,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;霉菌培養(yǎng)箱MJX-250B-2,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;光學(xué)顯微鏡XSP-2C,上海尚光顯微鏡有限公司;多用皇冠蓋壓蓋機(jī),鄭州玉祥包裝機(jī)械有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;101A-2電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱,上?？德穬x器設(shè)備有限公司;SW-CJ-1F潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;YN-ZD-10不銹鋼電熱蒸餾水器,上海博迅實業(yè)有限公司;無菌室,自制,在無菌室內(nèi)放潔凈工作臺,提高無菌程度;500mL、200mL壓口蓋玻璃酒瓶,分析用儀器等。2培養(yǎng)基配方的確定2.1MRS培養(yǎng)基的配制、改良MRS培養(yǎng)基的配制、麥芽汁培養(yǎng)基的配制、米曲汁培養(yǎng)基的配制、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制、米曲汁碳酸鈣培養(yǎng)基的配制。2.2樣品處理:傳統(tǒng)生麥曲、機(jī)制生麥曲、酒藥經(jīng)粉碎分別稱取1g;淋飯酒母、速釀酒母、傳統(tǒng)加飯酒發(fā)酵醪、機(jī)制加飯酒發(fā)酵醪取樣后在無菌室用一層經(jīng)滅菌過的紗布過濾后,接入。2.3無菌水試管:10mL蒸餾水試管在高壓滅菌鍋0.1Mpa滅菌30min,放入無菌室備用。2.4培養(yǎng)基的配制:取壇裝加飯酒,測定酒精度,而后加水稀釋至酒精度14.5%vol,加入總培養(yǎng)液量1.1%、1.3%、1.5%的“X”物質(zhì),加可溶性淀粉0.3%、0.5%、0.7%,充分?jǐn)噭蛉芙?200mL玻璃瓶分別裝10mL培養(yǎng)液,壓蓋密封,于85℃水浴鍋維持40min滅菌,冷卻后于18℃空白培養(yǎng)3天,而后于30℃空白培養(yǎng)2天,再在85℃水浴鍋維持40min滅菌,放無菌室備用?！癤”物質(zhì)的不同加量、可溶性淀粉的不同加量、培養(yǎng)溫度18℃、25℃、30℃進(jìn)行三因素三水平正交試驗如表1、表2。在無菌室把經(jīng)一層紗布過濾的發(fā)酵醪直接接入,壓蓋密封進(jìn)行培養(yǎng),每天觀察乳酸桿菌生長情況,與常規(guī)培養(yǎng)基對照,并詳細(xì)記錄。選擇出適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法。2.3測定:通過正交試驗選擇出的培養(yǎng)基配方,配制培養(yǎng)液,于200mL玻璃瓶每瓶分別灌10mL培養(yǎng)液,壓蓋密封;不加可溶性淀粉配制培養(yǎng)液,在500mL玻璃瓶每瓶分別灌300mL培養(yǎng)液,壓蓋密封;上述培養(yǎng)液于85℃水浴鍋維持40min滅菌,冷卻后于18℃空白培養(yǎng)3d,而后于30℃空白培養(yǎng)2d,再在85℃水浴鍋維持40min滅菌,放無菌室備用。樣品接入300mL優(yōu)選的培養(yǎng)基培養(yǎng)后測定酒精度、糖份、總酸、揮發(fā)酸,空白樣對照,樣品接入10mL培養(yǎng)基觀察生長速度。樣品稀釋后無菌接入上述優(yōu)選的培養(yǎng)基中,壓蓋密封,分別在18℃和30℃培養(yǎng),每天觀察培養(yǎng)液混濁情況,培養(yǎng)液混濁,進(jìn)行測定。測定酒精度、總酸(以乳酸計)、糖份(以葡萄糖計)、揮發(fā)酸(以乙酸計)。酒精度測定按《黃酒GB/T13662-2008》,總酸(以乳酸計)、糖份(以葡萄糖計)、揮發(fā)酸(以乙酸計)測定按參考文獻(xiàn),鏡檢,培養(yǎng)結(jié)束后觀察乳酸桿菌的形態(tài)。2.4初步鑒定:對照《伯杰細(xì)菌檢定手冊(第八版)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》進(jìn)行初步鑒定。3結(jié)果與分析3.1培養(yǎng)基的制備及純化3.1.1通過正交試驗和以前的試驗,黃酒發(fā)酵醪中優(yōu)勢菌的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法為:加飯酒稀釋至酒精度14.5%vol、加“X”物質(zhì)的量1.3%、加可溶性淀粉0.5%或不加,培養(yǎng)溫度18℃或30℃,壓蓋密封培養(yǎng),其他配方組成生長不佳。酒藥、酒母、生麥曲、發(fā)酵醪等中酵母在上述優(yōu)選的培養(yǎng)基中不生長,霉菌不生長。3.1.2傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵醪和機(jī)制黃酒發(fā)酵醪經(jīng)一層無菌紗布過濾后直接接入在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束測定結(jié)果如表3。3.1.3浸米漿水、酒藥、生麥曲、速釀酒母、淋飯酒母、傳統(tǒng)加飯發(fā)酵醪、機(jī)制加飯發(fā)酵醪直接接入優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束測定結(jié)果如表4。而浸米漿水、酒藥、生麥曲直接接入優(yōu)選的培養(yǎng)基中在18℃和30℃培養(yǎng)無菌生長。3.1.4傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵醪、機(jī)制黃酒發(fā)酵醪經(jīng)一層無菌紗布過濾后接入優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的培養(yǎng)液,在無菌室用無菌水稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8分別取1mL接入優(yōu)選的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),純化。并進(jìn)行性能測定。對照《伯杰細(xì)菌檢定手冊(第八版)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》進(jìn)行初步鑒定,初步鑒定為乳酸桿菌的新種,暫命名為黃酒乳酸桿菌Ⅱ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅡ),有兩類,一類為18℃生長良好,25℃及以上生長不良或生長極慢,但不會至其死亡,暫命名為黃酒乳酸桿菌Ⅱ-1(Lactobacilluschinese-rice-wineⅡ-1);另一類為30℃生長良好,20℃及以下生長緩慢或不生長,暫命名為黃酒乳酸桿菌Ⅱ-2(Lactobacilluschinese-rice-wineⅡ-2)。而在其他培養(yǎng)基中不生長。3.1.5黃酒乳酸桿菌Ⅱ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅡ)的性能:黃酒乳酸桿菌Ⅱ(Lactobacilluschineserice-wineⅡ)是在黃酒發(fā)酵醪中的優(yōu)勢菌,不能在現(xiàn)有報道的培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、米曲汁培養(yǎng)基等等)中生長,黃酒乳酸桿菌Ⅱ為厭氧或微需氧,不利用酒精,培養(yǎng)液中需酒精,乙醇能促進(jìn)其生長,能耐酒精14.5%voL左右,不能耐酒精17.0%voL,黃酒乳酸桿菌Ⅱ必需特定的維生素等微量成份,能液化淀粉和糊精,能分解蛋白質(zhì)為多肽和氨基酸,產(chǎn)胞外多糖(即粘稠物質(zhì)),產(chǎn)細(xì)菌素,能在低pH3.8左右生長,在pH4.0生長良好;83℃,10min能滅死黃酒乳酸桿菌Ⅱ。黃酒乳酸桿菌Ⅱ-1(Lactobacilluschinese-rice-wineⅡ-1),18℃生長良好,25℃及以上生長不良或生長極慢,但不會至其死亡,是黃酒后發(fā)酵醪中的優(yōu)勢菌,在黃酒發(fā)酵醪中形態(tài):單生、對生(———連接),對生較少,少量短鏈狀,直桿菌,以短的居多,不運動。黃酒乳酸桿菌Ⅱ-2(Lactobacilluschinese-rice-wineⅡ-2)為黃酒前發(fā)酵醪中較高發(fā)酵溫度中的優(yōu)勢菌,30℃生長良好,20℃及以下生長緩慢,在黃酒前發(fā)酵醪中形態(tài):單生、對生(--連接、八字形連接),八字形連接少,少量短鏈,極少量長鏈,直桿菌,不運動。3.2篩選耐酒精度較高的乳酸桿菌3.2.1通過正交試驗,優(yōu)選出了分離、培養(yǎng)發(fā)酵醪中黃酒乳酸桿菌的培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基14.5%voL的酒精抑制酵母的生長,在優(yōu)選的培養(yǎng)基中酵母不生長;14.5%voL的酒精、低pH4.0,及快速生長的乳酸桿菌能夠抑制霉菌的生長,霉菌在此培養(yǎng)基中不生長;芽孢桿菌在14.5%voL不生長。因此,分離、篩選黃酒乳酸桿菌方便,同時可快速分離、篩選耐酒精度的其他乳酸桿菌。3.2.2由于是壓蓋密封液體培養(yǎng),因此黃酒乳酸桿菌Ⅱ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅡ)的部分性能無法測定,而且是初步鑒定。3.2.3用優(yōu)選的培養(yǎng)基在18℃、30℃培養(yǎng)酒藥、麥曲,無菌生長;可能是優(yōu)選出的培養(yǎng)基沒有達(dá)到黃酒發(fā)酵醪的狀態(tài),而使酒藥、麥曲中休眠狀態(tài)的黃酒乳酸桿菌生長,需進(jìn)行一步研究。3.2.4從表3和表4可知:黃酒發(fā)酵醪中有異型乳酸桿菌存在,發(fā)酵醪直接入優(yōu)選出的培養(yǎng)基,異型乳酸桿菌同時快速生長,在產(chǎn)酸的同時,產(chǎn)一定量的酒精,酒精度升高。異型乳酸桿菌能從精氨酸產(chǎn)氨,被酵母利用產(chǎn)微量的EC。3.2.5從表3和表4可知:在酒母和前發(fā)酵醪中少有黃酒乳酸桿菌Ⅱ-1或黃酒乳酸桿菌Ⅱ-2,但在后發(fā)酵醪中大量存在,黃酒乳酸桿菌Ⅱ的來源是酒藥、麥曲、酒母、工器具、熟地。當(dāng)酒精度升高,其快速生長、繁殖,而成為優(yōu)勢菌。4結(jié)論和討論4.1白砂糖發(fā)酵培養(yǎng)基4.1.1運用正交試驗法,優(yōu)選出黃酒發(fā)酵醪中優(yōu)勢菌培養(yǎng)、分離的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法為:加飯酒稀釋至酒精度14.5%voL、加“X”物質(zhì)的量1.3%、加可溶性淀粉0.5%或不加、培養(yǎng)溫度18℃或30℃、壓蓋密封培養(yǎng)。此培養(yǎng)基也可以培養(yǎng)和檢測黃酒發(fā)酵醪、貯存酸敗黃酒中的乳酸桿菌及黃酒煎酒、瓶裝酒的滅菌效果。同時可快速分離、篩選高耐酒精度在其他食品中的乳酸桿菌或細(xì)菌。4.2不同菌株在酒精發(fā)酵中的生長4.2.1由于黃酒乳酸桿菌Ⅱ需壓蓋密封液體培養(yǎng),許多性能無法測定,而且是初步鑒定;有待于進(jìn)一步研究。4.2.2用優(yōu)選的培養(yǎng)基在18℃、30℃培養(yǎng)酒藥、麥曲,無菌生長;可能是優(yōu)選出的培養(yǎng)基沒有達(dá)到黃酒發(fā)酵醪的狀態(tài),而使酒藥、麥曲中休眠狀態(tài)的黃酒乳酸桿菌生長,需進(jìn)行一步研究。黃酒是用糯米、粳米、秈米、黑米、小米、黍米、玉米、青稞等為原料,以曲(麥曲、小曲、紅曲、米曲、大曲等)或酶作為糖化劑,酒母或酵母、細(xì)菌(乳酸菌)及曲中酵母、細(xì)菌(乳酸菌)作為發(fā)酵劑,經(jīng)浸米、蒸飯,通過不同種類的霉菌、酵母和細(xì)菌(乳酸菌、“黃酒乳酸桿菌”、益生菌)等參與的,(半甜、半干、干)黃酒(紹興酒)的發(fā)酵過程是邊糖化、邊酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精和邊細(xì)菌(乳酸菌、“黃酒乳酸桿菌”、益生菌)發(fā)酵產(chǎn)酸等協(xié)同混合作用的三邊發(fā)酵并行而釀成的一種釀造酒(發(fā)酵原酒),甜黃酒(香雪酒)是以細(xì)菌(乳酸菌)發(fā)酵為主,酵母作用小,是真正意義上的細(xì)菌(乳酸菌)為主的發(fā)酵;黃酒發(fā)酵過程,酵母、細(xì)菌(乳酸菌、“黃酒乳酸桿菌”、益生菌)等種類多和密度高,酵母和乳酸桿菌(黃酒乳酸桿菌)的變化和發(fā)酵非常復(fù)雜。近幾年研究報道:從黃酒發(fā)酵醪中分離鑒定出的乳酸桿菌有戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosusstrain)、棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformissubsp.Torquens)、希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)、植物乳酸桿菌(Lactobacillus.plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus.brevis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus.casei)、Lactobacillus.harbinensis、清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、類植物乳桿菌(Lactobacillusparaplantarum)、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)等等,在這些分離鑒定出的乳酸桿菌中,以植物乳酸桿菌為最多,因為植物乳酸桿菌的來源最廣,在黃酒釀造中作用最大。但黃酒釀造過程微生物種類特別多,有許多新的種及優(yōu)勢菌種,如黃酒發(fā)酵醪的優(yōu)勢菌,不能在現(xiàn)有報道的培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、米曲汁培養(yǎng)基、加碳酸鈣培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等等)中生長,因此無法檢測出。為檢測出這些黃酒發(fā)酵醪中的優(yōu)勢菌,試驗研究出了新的檢測和培養(yǎng)方法,報告如下。4.1.2黃酒后發(fā)酵醪中的優(yōu)勢菌,在上述培養(yǎng)基中18℃生長良好,25℃及以上生長不良或生長極慢,但不會至其死亡,在現(xiàn)有報道的培養(yǎng)基中不生長;這是以前從未報道過的乳酸桿菌,初步鑒定為乳酸桿菌的新種,