馮學(xué)亮教授課件

百令膠囊菌種鑒定報告

及抗腎纖維化作用的研究西安交大醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院馮學(xué)亮2009年10月27日冬蟲夏草冬蟲夏草是一種昆蟲和真菌的復(fù)合體.被寄生的蟲體是蟲草蝙蝠蛾的幼蟲.寄生的真菌是冬蟲夏草菌(cordycepssinensis(BerK.)Sacc.),它屬于真菌門,子囊菌綱,肉座菌目,麥角菌科,蟲草菌屬,冬蟲夏草種.

8月左右雪線以下，陰坡半陰坡5月5-15日8-9月間3-10攝氏度子囊孢子感染蝙蝠蛾幼蟲菌核（10月到次年五月,菌絲束）子座7月下旬子囊成熟分生孢子

長出牙管僵蟲冬蟲夏草生活史形成僵蟲過程2～3天內(nèi)

長出牙管冬蟲夏草生活史公元780年，藏醫(yī)藥學(xué)名著《月王藥診》：“治肺部疾病”。1757年，清·吳儀洛《本草從新》“冬蟲夏草味甘性平，入肺腎二經(jīng)，保肺益腎、補(bǔ)精髓、止血化痰，已勞嗽，治膈癥皆良?！?765年，清·趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》“冬蟲夏草治膈癥、蠱脹?！倍x夏草的藥用價值古代70多部中藥學(xué)文獻(xiàn)把冬蟲夏草的功用歸納為:"能陰陽并補(bǔ)，治勞嗽膈癥，諸虛百損；功與人參、鹿茸同，但藥性溫和，老少病虛者皆宜食用……。"同時，新中國建立以來，我國有200多部藥書詳細(xì)記載了冬蟲夏草的藥效與用途。冬蟲夏草的藥用價值冬蟲夏草的有效成分蟲草酸（甘露醇）、蟲草素（腺苷）、蟲草多糖、腺嘌呤、尿嘧啶、多球殼菌素;維生素B1、B2、B12、E等;還有人體必需的微量元素鋅、錳、鉀、磷等;以及多種必需的氨基酸等。蟲草酸：具有促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，清除自由基，抗過氧化損傷作用；蟲草素：具有抗菌.抗癌活性的核苷類物質(zhì)，對核多聚腺苷酸聚合酶有很強(qiáng)的抑制作用。抑制細(xì)菌和癌細(xì)胞生長。清除自由基，抗過氧化損傷作用,還有一定的降血糖作用;蟲草多糖：能促使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高血清IgG的抗體含量和機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體自身抗癌,抑癌的能力?？估w維化作用;腺苷：具有舒張血管、降低血壓、減慢心律,對心律有雙向調(diào)節(jié)作用;

冬蟲夏草野生資源逐年萎縮據(jù)統(tǒng)計(jì)，20世紀(jì)50年代以前全國年產(chǎn)量曾達(dá)100噸以上，60年代初為50噸至80噸，到90年代僅有5噸至15噸。雖然有關(guān)部門將冬蟲夏草列為國家二級保護(hù)物種，各地政府也出臺政策禁挖、限挖，但對冬蟲夏草的采挖并未得到遏制。目前世界上已發(fā)現(xiàn)同屬“蟲草屬”的蟲草已有三百五十種之多，其中在中國已發(fā)現(xiàn)過六十余種，包含：冬蟲夏草和蟲草冬蟲夏草（C.sinensis）北冬蟲夏草(C.militaris)大團(tuán)蟲草（C.ophioglossoides）亞香棒蟲草(C.hawkesii)

古尼蟲草(C.gunnii)

珊瑚蟲草(C.martialis)鐮刀狀蟲草(C.falcata)泰山蟲草(C.taishanensis）山西蟲草(C.shanxiensis)

涼山蟲草(C.liangshanensis)新疆蟲草(C.gracilis)

香棒蟲草(C.barnesii)等……蟬花分布于安徽（淮北）、四川（都江堰）以及云南、江蘇、浙江、福建和湖北等省。蛹蟲草分布于河北、吉林、陜西、安徽、云南、廣西、貴州、四川、臺灣以及廣東、湖北、湖南和山西等省。冬蟲夏草和蟲草蟻蟲草分布于安徽、江蘇、浙江、四川、云南、廣西、廣東和湖北等省。下垂蟲草分布于吉林、安徽、湖北、浙江、貴州、四川、廣西、和海南等省。冬蟲夏草和蟲草冬蟲夏草和蟲草金龜子蟲草黃蜂蟲草大團(tuán)囊蟲草珊瑚蟲草雖然已發(fā)現(xiàn)的品種繁多，但其中具有藥用價值的品種卻并不多；有些還具有毒性，錯誤服用后可能會直接破壞人體的肌體功能。冬蟲夏草和蟲草最具有價值的是：

冬蟲夏草（Cordycepssinensis（Berks.）Sacc.）冬蟲夏草雖然藥用價值較高，但因其數(shù)量有限，價格過于昂貴,畢竟不能進(jìn)入尋常百姓之家。中科院微生物研究所開展的《冬蟲夏草及其相關(guān)類群的分子系統(tǒng)學(xué)分析》的課題已經(jīng)證明：百令膠囊生產(chǎn)菌就是天然冬蟲夏草的無性型。冬蟲夏草VS百令膠囊從已知的化學(xué)成分看,其生物活堿、甾醇、甘露醇、微量元素、氨基酸的含量和百分比都與天然冬蟲夏草一致。冬蟲夏草及其相關(guān)類群的分子系統(tǒng)學(xué)分析魏鑫麗,印象初,郭英蘭,沈南英,魏江春<<菌物學(xué)報>>2006年第25卷第02期國家創(chuàng)新經(jīng)費(fèi)贊助(編號0110)實(shí)驗(yàn)背景藥用真菌的物種科學(xué)名稱是否準(zhǔn)確,是一個國家真菌科學(xué)水平的標(biāo)志,更是能否保護(hù)我國自主知識產(chǎn)權(quán)的關(guān)鍵。中華束絲孢與中國被毛孢是否等同？印象初院士于2001年10月18日上午約魏江春院士交談上述問題，建議魏江春院士能主持澄清上述學(xué)術(shù)爭議問題。中國科學(xué)院真菌與地衣系統(tǒng)學(xué)開放實(shí)驗(yàn)室1990年的學(xué)術(shù)委員會年會上立項(xiàng)問題。Hirsutellahepialichenetshen,sp.nov

中國被毛孢（百令）Paecelonvyceshepiali

蝙蝠蛾擬青霉（金水寶）Mortierellahapialia

蝙蝠蛾被孢霉（至靈）Cephalosporiumdongchongxiacao

蟲草頭孢菌（寧心寶）等等。。。市場上冬蟲夏草菌種很多，也很混亂人工蟲草研究目標(biāo)Ⅰ中華束絲孢與冬蟲夏草之間的親緣關(guān)系？冬蟲夏草菌Cordycepssinensis中國被毛孢Hirsutellasinensis中華束絲孢Synnematiumsinense親緣關(guān)系？蝙蝠蛾擬青霉與冬蟲夏草之間的親緣關(guān)系？蝙蝠蛾擬青霉Paecilomyceshepiali親緣關(guān)系？研究目標(biāo)Ⅱ冬蟲夏草菌Cordycepssinensis中國被毛孢Hirsutellasinensis產(chǎn)品名生產(chǎn)菌說明至靈膠囊蝙蝠蛾被孢霉被孢霉屬真菌，在親緣關(guān)系上與子囊菌相距甚遠(yuǎn)，屬于結(jié)合菌門成員。心肝寶膠囊粉紅膠霉“粉紅膠霉”是一種真菌寄生菌；膠霉屬是肉座菌科小燦球赤殼菌屬的無性型。寧心寶膠囊蟲草頭孢根據(jù)其發(fā)酵生產(chǎn)周期為3－5天以及溫度為25－35℃便可推知，并非冬蟲夏草菌的無性型。無論是至靈、寧心寶和心肝寶膠囊的生產(chǎn)菌均非冬蟲夏草菌的無性型分子水平一致編號菌株號名稱產(chǎn)地有性型S4=Cs-Q無冬蟲夏草（Cordycepssinensis(Berk.)Sac.）

青海G3=Cs-S無冬蟲夏草（Cordycepssinensis(Berk.)Sac.)四川無性型G2=Hs-SGuo-2中國被毛孢（HirsutellasinensisLiuetal.）

四川S1=Ss-Q0207中華束絲孢（SynnematiumsinenseYin&Shen）

青海S2=Ss-Q上020中華束絲孢

(SynnematiumsinenseYin&Shen)

青海S3=SsKD0205F9中華束絲孢

(SynnematiumsinenseYin&Shen)青海S5=PhCs-4蝙蝠蛾擬青霉（PaecilomyceshepialiChenetDai）青海外群G4=Pm-Guo無蛹草擬青霉（PaecilomycesmilitarisLiang）

吉林供試材料編號、名稱、產(chǎn)地及提供者總DNA提?。翰捎酶牧糃TAB法（Rogers&Bendich,1988）。DNA隨機(jī)擴(kuò)增多型性(RAPD)分析擴(kuò)增反應(yīng)：95℃5分鐘，1個循環(huán)，94℃，1分鐘，36℃1分鐘，72℃2分鐘，40個循環(huán)；最后72℃2分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，80V，2小時。隨機(jī)引物的選用：從華美公司試劑盒中選擇了6個隨機(jī)引物：

S23（AGTCAGCCAC），

S33（CAGAACCCAC），

S61（TTCGAGCCAG），

S146（AAGACCCCTC），

OPW-06（AGGCCCGATG），

OPV-14（AGATCCCGCC）。RAPD反應(yīng)體系（25μl）含有：25mMMgCl21.5μl，2.5mMdNTP1.5μl，10μM引物2μl，10×Buffer2.5μl，3U/μlTaq酶0.5μl，模板（稀釋50倍）0.5μl，無菌去離子水16.5μl。6個隨機(jī)引物的圖譜利用PAUP分析6條引物的RAPD圖譜所得的樹型圖（Distancemethod；bootstrap=1000；UPGMA），節(jié)間數(shù)字代表bootstrap值。分子水平一致PCR擴(kuò)增、測序及分析：通過PCR從供試菌株總DNA中進(jìn)行核rDNAITS區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)堿基序列的擴(kuò)增；引物選用ITS4和ITS5(Whiteetal.,1990)；PCR產(chǎn)物由上海博亞和基康公司測序。測序結(jié)果利用軟件DNAMAN4.0進(jìn)行比對；利用Mega2進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析（Kumaretal.,2001）；采用Kimura2-parameter模式，存在缺失時成對刪除；構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹采用NJ法，重復(fù)運(yùn)算1000次（bootstrap=1000）。nrDNA間隔區(qū)(ITS)序列分析rDNAgene結(jié)構(gòu)模式圖123456789101112細(xì)菌古菌真核生物保守區(qū)(相似性70%以上)高變區(qū)16S16SISR23SISR23S17S-18S5.8SITS1ITS225S-28S中間省略……分子水平一致分子水平一致節(jié)間數(shù)字代表bootstrap值（低于50％因不是同一類群而未標(biāo)識）。分子水平一致內(nèi)群1冬蟲夏草

Cordycepssinensis中國被毛孢

Hirsutellasinensis外群2蝙蝠蛾擬青霉

Paecilomyceshepiali外群3蛹草擬青霉

Paecilomycesmilitaris建議鑒于具有創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn),為了保護(hù)知識產(chǎn)權(quán),提出下列建議：I、百令膠囊：

1、將百令膠囊生產(chǎn)菌的菌種名稱盡快更正為:中國被毛孢（HirsutellasinensisLiuetal.

）

2、將百令膠囊的成分更正為：冬蟲夏草發(fā)酵菌粉II、金水寶膠囊：

1、鑒于具有創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn),建議將金水寶膠囊生產(chǎn)菌蝙蝠蛾擬青霉的拉丁學(xué)名PaecilomyceshepialiChenetDai（不合格名稱）盡快進(jìn)行合格化發(fā)表,以實(shí)現(xiàn)該名稱的合法性，從而得到保護(hù)名稱和自主知識產(chǎn)權(quán)的。

2、將金水寶膠囊成分更正為：蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌粉III、為國家藥監(jiān)部門提出建議百令在基礎(chǔ)和臨床方面的研究日益受到關(guān)注。90年代以來在國家級的雜志上作為論著文章累計(jì)150余篇。主要臨床功用體現(xiàn)在以下方面：百令在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用腎內(nèi)科：有效改善腎功能，拮抗腎纖維化。移植科：促進(jìn)細(xì)胞增生，防治CsA腎毒性。呼吸科：降低氣道阻力，提高肺順應(yīng)性。肝科：抗纖維化，抗氧化。腫瘤科：拮抗毒性，升白，提高機(jī)體免疫功能。內(nèi)分泌：治療自身免疫性甲狀腺疾病。等等……蟲草菌液拮抗馬兜鈴酸對人近端腎小管上皮細(xì)胞的作用芮宏亮諶貽璞等中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30170429)衛(wèi)生部屬(管)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng)目(2005-2007年度)方法及材料采用體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞系HKC細(xì)胞。馬兜鈴酸鈉鹽(AA)刺激細(xì)胞濃度為40mg/ml。冬蟲夏草菌液由杭州中美華東制藥有限公司提供。刺激細(xì)胞時藥物濃度為10mg/ml。此二種藥物試驗(yàn)前均已進(jìn)行細(xì)胞增殖作用及毒性效應(yīng)檢測(MTT試驗(yàn)及LDH試驗(yàn))。芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期實(shí)驗(yàn)指標(biāo)CTGF是TGF-β發(fā)揮前纖維化活性的一個重要下游因子。PAItPATIMP纖溶酶MMPECM降解芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期實(shí)驗(yàn)流程HKC細(xì)胞A:對照組B:蟲草菌液組C:馬兜鈴酸組D:馬兜鈴酸＋蟲草菌液組刺激12小時后刺激36小時后裂解細(xì)胞，用RT-PCR測定TGF-β1、CTGF、PAI-1和TIMP-1mRNA表達(dá)收集上清，用ELISA法測定TGF-β1、PAI-1和TIMP-1蛋白質(zhì)表達(dá)裂解細(xì)胞，用Westernblot測定CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)統(tǒng)計(jì)、分析芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期TGF-β1mRNA表達(dá)變化ABCDβ-ActinTGF-β1A組：對照組B組：蟲草菌液組C組：AA組D組：AA+蟲草菌液組MTGF-beta1mRNA*#與對照組比較*p<0.05與AA組比較

#p<0.05(n=3)芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期TGF-β1蛋白質(zhì)表達(dá)變化A組：對照組B組：蟲草菌液組C組：AA組D組：AA+蟲草菌液組TGF-beta1(ng/L)與對照組比較*p<0.05與AA組比較

#p<0.05(n=4)*#*芮宏亮諶貽璞等,