基因工程制藥-基因工程制藥技術(shù)

基因工程制藥技術(shù)（二）一、基因工程菌的培養(yǎng)過程1、搖瓶培養(yǎng)確定菌體生長基礎(chǔ)條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基組成、表達(dá)產(chǎn)物合成對工程菌的影響等。2、發(fā)酵罐培養(yǎng)確定培養(yǎng)方案、培養(yǎng)參數(shù)。二、基因工程菌的培養(yǎng)方式1、分批培養(yǎng)2、補(bǔ)料分批培養(yǎng)3、連續(xù)培養(yǎng)4、透析培養(yǎng)指利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來接觸其生產(chǎn)菌的不利影響。5、固定化培養(yǎng)固定化可以提高重組菌的穩(wěn)定性，重組菌進(jìn)行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的基因產(chǎn)物的產(chǎn)率都有很大提高，許多宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。三、影響基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的因素(一)、基因工程菌與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵工藝的差異傳統(tǒng)微生物發(fā)酵主要收獲的是初級或次級代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)?；蚬こ叹l(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。培養(yǎng)基接種量培養(yǎng)條件（溫度、pH、溶氧等）誘導(dǎo)時(shí)間（二）、影響重組菌發(fā)酵的因素1、培養(yǎng)基碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素等基因工程菌通常具有選擇性標(biāo)記基因，在培養(yǎng)基中應(yīng)添加相應(yīng)的成分。2、接種量接種量大小影響菌體生長繁殖速率3、培養(yǎng)溫度（1）在復(fù)制水平上，溫度可影響基因拷貝數(shù)量（2）在轉(zhuǎn)錄水平上，溫度可影響RNA聚合酶的作用（3）在翻譯水平上，還可以通過小分子蛋白質(zhì)合成水平來影響基因表達(dá)（4）溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包涵體的形成例如，重組人生長激素工程菌，在30℃時(shí)的產(chǎn)物是可溶的，而在37℃所表達(dá)出的蛋白質(zhì)則是不溶的4、溶解氧的影響外源基因的高效表達(dá)和翻譯需要維持較高水平的溶氧。通常采用改變轉(zhuǎn)速的方法，改善氧的供給5、pH的影響影響細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)。不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對重組蘇氨酸脫水酶的影響6、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響案例1重組蘇氨酸脫水酶的基因表達(dá)案例2L-天冬氨酸酶的表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對L-天冬氨酸酶表達(dá)水平和活力的影響生物量（A600*10）酶活力酶表達(dá)水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)：各種酶的誘導(dǎo)劑或改變溫度、pH等培養(yǎng)條件。誘導(dǎo)方式：7、誘導(dǎo)時(shí)間對外源蛋白表達(dá)的影響誘導(dǎo)時(shí)間：又叫誘導(dǎo)時(shí)長，加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時(shí)間。比酶活時(shí)間t不同誘導(dǎo)時(shí)長對重組蘇氨酸脫水酶比酶活的影響隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。小結(jié)1、基因工程菌的培養(yǎng)過程和培養(yǎng)方式2、影響基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的因素3、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間對重組菌發(fā)酵生產(chǎn)的影響作業(yè)1、影響基因工程菌發(fā)酵的因素有哪些？2、基因工程菌和傳統(tǒng)微生物發(fā)酵的區(qū)別是什么？基因工程制藥技術(shù)目的基因的分離重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá)目的基因與載體的連接含重組體的受體細(xì)胞的篩選表達(dá)產(chǎn)物的分離純化鑒定010305020406一、基因工程的基本操作過程質(zhì)粒受體菌篩選轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒限制性酶切DNA連接酶目的基因含目的基因的外源DNA限制性酶切非轉(zhuǎn)化菌轉(zhuǎn)化菌上游：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成?；蚬こ趟幬锷a(chǎn)的基本操作步驟下游：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。獲得目的基因

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構(gòu)建重組質(zhì)粒

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組建基因工程細(xì)胞

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工程菌培養(yǎng)

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產(chǎn)物分離純化將目的基因與載體連接后，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，即獲得基因工程菌該過程也稱為基因工程的上游技術(shù)（一）基因工程菌的構(gòu)建與篩選特點(diǎn)：只能合成小于100個(gè)堿基的特定序列自動(dòng)化程度高合成速度較快（1）化學(xué)合成法：將已知序列的目的基因利用化學(xué)合成的方法直接合成。1、目的基因的制備即反轉(zhuǎn)錄法。利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱為cDNA文庫。降解mRNA模板cDNA第二鏈的合成cDNA與載體連接總mRNA提取mRNA的分離純化cDNA第一鏈的合成一般步驟（2）cDNA文庫法根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制原理，在DNA聚合酶催化下，以來DNA模板特異性擴(kuò)增DNA。特點(diǎn)：可在體外大量特異性擴(kuò)增目的基因，實(shí)驗(yàn)室常用（3）PCR法PCR儀載體是攜帶外源目的基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因無性繁殖或表達(dá)有意義蛋白質(zhì)所采用的DNA分子。包括質(zhì)粒載體、病毒（包括噬菌體）等。2、載體具有有效運(yùn)載能力載體自身能夠獨(dú)立復(fù)制，并能在宿主內(nèi)進(jìn)行自主性復(fù)制必須有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上必須帶有標(biāo)志基因，以便進(jìn)行重組后的篩選基因工程載體必備條件載體應(yīng)具有啟動(dòng)子載體應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，因?yàn)橥庠椿虻母咝П磉_(dá)會(huì)抑制宿主細(xì)胞的生長、增殖，而阻遏子可是宿主細(xì)胞免受這種影響應(yīng)具有終止子，以便重點(diǎn)克隆外源基因區(qū)域，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)基因所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，以便轉(zhuǎn)錄之后能夠順利進(jìn)行翻譯。概念：指獨(dú)立于原核生物染色體之外具有自主復(fù)制能力的遺傳物質(zhì)。特征：具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，并隨宿主細(xì)胞的分裂傳遞給后代可編碼自身蛋白質(zhì)，對宿主生存無決定性影響質(zhì)粒載體（1）復(fù)制子又稱復(fù)制起始區(qū)，包含控制質(zhì)粒DNA復(fù)制起點(diǎn)和質(zhì)?？截悢?shù)等遺傳因素用于克隆表達(dá)的載體需要具有以下特征（2）多克隆位點(diǎn)指位于質(zhì)粒中的一段序列，這段序列中含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，且這些位點(diǎn)是單一酶切位點(diǎn)?？股乜剐曰颍喊逼S青霉素，氯霉素，四環(huán)素、卡那霉素等。含有抗生素抗性基因質(zhì)粒質(zhì)粒的宿主細(xì)胞能在含抗生素的環(huán)境中生長。用于克隆表達(dá)的載體需要具有以下特征（3）選擇性標(biāo)記用于篩選轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，是質(zhì)粒攜帶的賦予宿主細(xì)胞新的表型的基因。連接酶催化載體與目的基因DNA片段連接，形成重組子粘性末端的連接平頭末端的連接3、目的基因與載體的連接常使用T4連接酶通常采用轉(zhuǎn)化的方法。轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)時(shí)可以獲取外源遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞某些遺傳性狀發(fā)生改變。4、重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞抗藥性基因的檢測（最常見）基本原理抗藥性篩選法可區(qū)分重組子與非重組子將外源DNA插入BamHⅠ位點(diǎn)：重組子呈現(xiàn)Apr、Tcs非重組子呈現(xiàn)

Apr、Tcr

5、重組子的篩選與鑒定

圖2圖1野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶分解X-gal成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)，從而使整個(gè)菌落變成藍(lán)色。藍(lán)白斑篩選在插入外源基因后，突變型菌體的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切斷，無法形成完整的β